применение флаванолигнанов в качестве лекарственных средств, обладающих антипролиферативной активностью в отношении опухолей матки, яичника и молочной железы

Формула изобретения

1. Применение флаванолигнанов, выбранных из силимарина, силибина (синоним - силибинин), силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащих их экстрактов, в качестве лекарственных средств, обладающих антагонистической активностью в отношении эстрогенных рецепторов типа II и антипролиферативной активностью в отношении опухолей матки, яичника и молочной железы.

2. Применение комплексов флаванолигнанов, выбранных из силимарина, силибина (синоним - силибинин), силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащих их экстрактов, с фосфолипидами в качестве лекарственных средств обладающих антагонистической активностью в отношении эстрогенных рецепторов типа II и антипролиферативной активностью в отношении опухолей матки, яичника и молочной железы.

3. Комбинация фармацевтической композиции, обладающей антагонистической активностью в отношении эстрогенных рецепторов типа II и антипролиферативной активностью в отношении опухолей матки, яичника и молочной железы, содержащей в качестве активного ингредиента флаванолигнаны, выбранные из силимарина, силибина (синоним - силибинин), силидианина, силикристина, дегидросилибина, их смесей или содержащих их экстрактов, необязательно в форме комплексов с фосфолипидами, с противоопухолевыми агентами.

4. Комбинация по п.3, пригодная для перорального введения.

5. Комбинация по п.4, содержащая в качестве носителя жидкие полусинтетические глицериды жирных кислот со средней длиной цепи.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к применению флаванолигнанов, в отдельности или в комбинации с известными химиотерапевтическими агентами, для изготовления лекарственных средств для лечения и профилактики опухолей матки, яичника и молочной железы.

Недавно было установлено, что некоторые флавоноиды обладают противоопухолевой активностью (Verna, Cancer Research 48, 5754, 1988) и химиопрофилактической активностью в отношении некоторых опухолей (Cassady, J. Nat. Prod. 53, 23, 1990). В частности, было показано, что кверцетин, флавоноид, который присутствует почти во всех растениях, оказывает некоторое ингибирующее действие на пролиферацию лейкозных клеток человека (Larocca, Br. J. оf Haemotology 75, 489, 1990) и на другие клеточные линии (Scambia, Br. J. Cancer 62, 942, 1990 - Int. J. Cancer 46, 1112, 1990 - Cancer Chemother. Pharmacol, 28, 255, 1991 - Gynecologic Oncology 45, 13, 1992), и помимо этого обладает синергической активностью при использовании с обычными средствами химиотерапии. Хотя механизм такого ингибирующего воздействия на пролиферацию неизвестен, представляется, что он связан с взаимодействием этого флавоноида с эстрогеновыми рецепторами типа II (Markaverich, J. Steroid Biochem. 30, 71, 1988). Эти рецепторы, впервые описанные Clark (J. Biol. Chem. 253, 7630, 1978) в матке крысы, отличаются от истинных эстрогеновых рецепторов (ER), поскольку они присутствуют в более высокой концентрации и имеют константу диссоциации сродства для эстрадиола (K_D: 10-20 нМ) ниже, чем у эстрогеновых рецепторов (К_D: 0,2-1 нМ).

В настоящее время неожиданно обнаружили, что флаванолигнаны, в том числе силимарин, уже широко применяющиеся в терапии для лечения заболеваний печени различной природы, три главных компонента которых известны под названием силибин, силидианин, силикристин и дегидросилибин и имеют следующее строение:







обладают высоким сродством к эстрогеновым рецепторам типа II и весьма значительной антипролиферативной активностью в отношении клеточных линий опухолей матки, яичника и молочной железы, резистентных к цисплатину и адриамицину. С целью верификации антипролиферативного эффекта флаванолигнанов изучались кривые роста различных стабилизированных клеточных линий, полученных из различных опухолей человека, в присутствии этих соединений и оценивалась их способность взаимодействовать с EBS типа II на примере карциномы яичника.

Определение связывания с эстрогеновыми рецепторами выполняли на клетках опухоли яичника или опухолей других органов, которые культивировали в монослое в модифицированной по способу Дульбекко среде с добавлением сыворотки теленка и 200 единиц/мл пенициллина. Клетки, которые использовались для этих тестов, трипсинизировали каждую неделю и помещали в чашку с плотностью 8 10^-4/мл, после чего инкубировали при 37^oC в увлажненной атмосфере, содержавшей 5% CO₂. Для контроля антипролиферативной активности этих продуктов клетки помещали в лунки (Falcon 3046, Becton Dickinson NY) в концентрации 4 10⁴/мл. Спустя 24 часа среду заменяли на свежую и добавляли флаванолигнаны, растворенные в абсолютном этаноле. Контроли обрабатывали при тех же экспериментальных условиях только носителем, в отсутствие активного ингредиента. Обработку, описанную выше, повторяли с 24-часовыми интервалами в течение 72 часов эксперимента. Ингибирование пролиферации клеток оценивали по прямому подсчету клеток, сравнивая рост в контроле с ростом обработанных образцов.

Для дозировки рецепторов клетки спустя 24 часа инкубировали с возрастающими количествами меченого эстрадиола (³H-Е2 40 Ки/ммоль, Amershan UK) в отдельности или в присутствии 100-кратного количества диэтилстильбэстрола при ^oC в течение 2,5 часов.

По окончании времени инкубирования клетки быстро отмывали свежим субстратом и инкубировали в течение 30 минут с 1 М NaOH. Радиоактивность измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика, а специфичность связывания подсчитывали по разнице между препаратами, содержавшими и не содержавшими диэтилстильбэстрол. Результаты выражали в виде количества сайтов связывания на клетку, согласно обычным способам, описанным в литературе (Raneletti, 1988).

Ингибирование пролиферации клеток оценивали путем прямого подсчета клеток, сравнивая рост в контроле с ростом обработанных образцов.

Результаты по различным клеточным линиям представлены на чертеже и в таблицах I и V. В частности, чертеж показывает антипролиферативную активность силибина на А2780 WT, ER негативной клеточной линии карциномы яичника положительного типа II.

Эти результаты представляют собой средние величины по двум экспериментам, выполнявшимся в трех повторностях каждый. Стандартное отклонение составляет менее 10%.

Антипролиферативная активность является дозозависимой. В таблице 1 представлены данные, относящиеся к действию силибина в концентрациях от 0,01 мкМ до 20 мкМ на пролиферацию клеток; силибин оказывал дозозависимое антипролиферативное действие на различные клеточные линии, включая резистентные к средствам химиотерапии (MCF - 7 ADRr, А2780 CIS), при IC₅₀ от 4,8 до 24 мкМ.

С целью дальнейшего изучения антипролиферативной активности силибина исследовали действие этого вещества на цикл клеток А2780 WT. Как показано в таблице II, цитофлюорометрический анализ обнаружил, что силибин вызывает снижение процентной доли клеток в фазе S и умеренное (незначительное) возрастание процентной доли клеток в фазе GO/G1.

На базе этих результатов силибин испытывался на любое усиление эффекта некоторых химиотерапевтических средств, в частности, цисплатина (CIS) и адриамицина (ADR). Как показано в таблице III, когда силибин применяли в комбинации с CIS, наблюдали синергическое ингибирующее действие на рост по сравнению с соответствующими дозами этих лекарственных средств по отдельности.

Сходные результаты были получены при применении силибина в комбинации с ADR (табл. IV).

С целью проверки, является ли этот эффект комбинации силибина с адриамицином или цисплатином результатом синергического или суммарного действия, эти данные были проанализированы с помощью изоболического метода Berenbau (Adv. Cancer Res., 25, 269, 1981). Полученный комбинационный индекс был меньше 1 как в родительской (А2780 WT, табл. III), так и в резистентной (MSF7, ADRr, табл. IV) клеточных линиях, что доказывает синергическую природу антипролиферативной активности комбинации этих двух лекарственных средств.

Антипролиферативная активность силибина и его аналогов наблюдается не только на стабилизированных клеточных линиях, но и на первичных культурах опухолевых клеток человека. Множество изученных флавонолигнанов показало те же свойства. В таблице V приводятся данные, относящиеся к силибину, силидианину, силимарину и дегидросилибину. Диастереомерные формы силибина и изосилибина также очень активны в этих исследованиях.

Более того, существуют доказательства того, что упомянутые выше флаванолигнаны ингибируют пролиферацию клеток in vivo, полученные путем измерения размеров опухолей, имплантированных голым бестимусным мышам, согласно стандартной методике, описанной в литературе. Лечение животных дозами от 1 до 100 мг/кг приводило к выраженной регрессии изучавшихся опухолей вплоть до исчезновения у большой части животных. Эти продукты показали более высокую активность у человека в отношении опухолей яичника, молочной железы и матки, чем известные лекарственные средства, такие как тамоксифен.

Силидианин, дегидросилибин и две диастереоизомерные формы силибина показали особенно выраженную активность. В тестах in vitro использовали флаванолигнаны как таковые, в то время как в исследованиях in vivo использовались их комплексы с фосфолипидами, описанные в ЕР-А-0209038.

Согласно настоящему изобретению, флаванолигнаны можно вводить перорально или путем инфузии: для перорального пути введения в качестве носителей особенно пригодны натуральные или синтетические фосфолипиды, поскольку они образуют упомянутые выше жирорастворимые стабильные комплексы с указанными соединениями; а также жидкие полусинтетические глицериды, содержащие триглицериды жирных кислот со средней длиной цепи, или их аналоги, которые могут облегчать биодоступность отдельных соединений, их натуральных смесей или содержащих их экстрактов.

Дозы флаванолигнанов для человека составляют от 50 до 1500 мг в день, которые вводят, главным образом, пероральным путем.

Настоящее изобретение также относится к композициям, содержащим силимариновые флаванолигнаны и противоопухолевый агент в форме комбинаций для одновременного, последовательного или раздельного применения в противоопухолевой терапии.

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение.

Пример 1

Твердые желатиновые капсулы, содержащие комплекс силибина и соевого фосфатидилхолина.

Композиция:

Комплекс силибина и соевого фосфатидилхолина - 300 мг

Натрий-карбоксиметилцеллюлоза - 16 мг

Тальк - 6 мг

Стеарат магния - 3 мг

Пример 2

Мягкие желатиновые капсулы, содержащие дегидросилибин.

Композиция:

Дегидросилибин - 250 мг

Жидкие полусинтетические глицериды - 300 мг

Частично гидрогенизированные растительные масла - 49 мг

Соевый лецитин - 1 мг

Пример 3

Твердые желатиновые капсулы, содержащие комплекс силимарина и соевых натуральных фосфолипидов.

Композиция:

Комплекс силимарина и соевых натуральных фосфолипидов - 360 мг

Натрий-карбоксиметилцеллюлоза - 21 мг

Тальк - 6 мг

Стеарат магния - 3 мг

Пример 4

Твердые желатиновые капсулы, содержащие комплекс силидиамина и соевого фосфатидилхолина.

Композиция:

Комплекс силидианина и соевого фосфатидилхолина - 200 мг

Натрий-карбоксиметилцеллюлоза - 10 мг

Тальк - 3 мг

Стеарат магния - 2 мг