водный раствор фактора viii со сниженной концентрацией кислорода

Формула изобретения

1. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII, отличающийся тем, что он включает фактор свертывания крови VIII с активностью от 10 до 100.000 МЕ/мл в водном растворе со сниженной концентрацией кислорода.

2. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит инертный газ.

3. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по п.1, отличающийся тем, что в качестве инертного газа используют азот.

4. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по пп.1 - 3, отличающийся тем, что водный раствор дополнительно содержит, по меньшей мере, один антиоксидант, такой, как глутатион, ацетилцистеин, метионин, токоферол, бутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол или фенольные соединения.

5. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по п.4, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта используют, по меньшей мере, одно соединение, выбранное из группы, состоящей из глутатиона, ацетилцистеина и метионина.

6. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп. 1 - 5, отличающийся тем, что в качестве фактора свертывания крови VIII используют высокоочищенный фактор свертывания крови VIII, а раствор является стабильным без добавления альбумина.

7. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп. 1 - 5, отличающийся тем, что в качестве фактора свертывания крови VIII используют фактор свертывания крови полной длины или фрагмент рекомбинантного фактора VIII.

8. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп.1 - 7, отличающийся тем, что используют активный фактор свертывания крови VIII в концентрации от 50 до 10.000 МЕ/мл.

9. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп.1 - 8, отличающийся тем, что используют водный раствор, дополнительно содержащий неионный поверхностно-активный агент.

10. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по п.9, отличающийся тем, что используют неионный поверхностно-активный агент в количестве, превышающем критическую концентрацию мицеллообразования.

11. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп. 9 и 10, отличающийся тем, что в качестве неионного поверхностно-активного агента используют неионный поверхностно-активный агент, выбранный из блок-сополимеров или эфира жирной кислоты и полиоксиэтилен сорбитана.

12. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп.1 - 11, отличающийся тем, что используют водный раствор, дополнительно содержащий соль кальция, такую, как хлорид кальция или глюконат кальция, предпочтительно в количестве, превышающем 0,5 мМ.

13. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп.1 - 12, отличающийся тем, что используют водный раствор, дополнительно содержащий аминокислоту, такую, как L - гистидин, в количестве, превышающем 1 мМ.

14. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови XIII по любому из пп.1 - 13, отличающийся тем, что используют водный раствор, дополнительно содержащий моно- или дисахариды или сахароспирты, предпочтительно сахарозу.

15. Стабильный водный раствор фактора свертывания крови VIII по любому из пп. 1 - 14, отличающийся тем, что используют водный раствор, содержащий 10-100.000 МЕ/мл рекомбинатного фактора свертывания крови VIII, по меньшей мере, 0,01 мг/мл эфира жирной кислоты и полиоксиэтилен сорбитана, хлорид натрия, предпочтительно в количестве, превышающем 0,1М, соль кальция, такую, как хлорид кальция или глюконат кальция, предпочтительно в количестве, превышающем 0,5 мМ, аминокислоту, такую, как L - гистидин в количестве, превышающем 1мМ, моно- или дисахарид или сахароспирт, предпочтительно сахарозу или маннит.

16. Способ получения стабильного водного раствора фактора свертывания крови VIII по любому из пп.1 - 15, отличающийся тем, что фактор свертывания крови VIII смешивают с водным раствором до получения раствора с активностью от 10 до 100.000 МЕ/мл и снижают концентрацию кислорода путем воздействия на раствор атмосферной инертного газа.

17. Способ получения стабильного водного раствора по п.16, отличающийся тем, что фактор свертывания крови VIII смешивают с водным раствором и снижают концентрацию кислорода путем снижения давления и последующего введения инертного газа, предпочтительно повторяющегося в нескольких циклах.

18. Способ получения стабильного водного раствора по любому из пп.16 и 17, отличающийся тем, что фактор свертывания крови VIII элюируют на последнем этапе очистки водным буферным раствором и снижают концентрацию кислорода путем воздействия на раствор атмосферой инертного газа.

19. Способ получения стабильного водного раствора по любому из пп.16 - 18, отличающийся тем, что фактор свертывания крови VIII элюируют на последнем этапе очистки водным буферным раствором и снижают концентрацию кислорода путем снижения давления и последующего введения инертного газа, предпочтительно повторяющегося в нескольких циклах.

20. Способ получения стабильного водного раствора по любому из пп.16 - 19, отличающийся тем, что водный раствор содержит, по меньшей мере, одно добавочное вещество, выбранное из группы, состоящей из неионного поверхностно-активного агента, антиоксиданта, аминокислоты, такой, как L - гистидин, соли натрия, соли кальция и сахарозы.

Описание изобретения к патенту

Настоящее изобретение отосится к конечному лекарственному продукту, включающему фактор свертывания крови VIII в водном растворе со сниженной концентрацией кислорода. В такой форме активность фактора VIII может поддерживаться в течение срока хранения на необычайно высоком уровне. Активность фактора VIII может сохраняться в течение длительного периода времени, если конечное лекарственное средство включает дополнительно инертный газ и/или антиокосидант. Настоящее изобретение относится также к способам снижения концентрации кислорода в водном растворе и к способу улучшения стабильности фактора VIII в водном растворе путем хранения этого раствора в атмосфере инертного газа. С помощью настоящего изобретения стало возможным сохранять по меньшей мере 50% первоначальной активности фактора VIII после хранения в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре от 2 до 10% и pH раствора от 6,5 до 8,5.

Предпосылки к созданию изобретения

Стабильность белков является одной из главных проблем фармацевтической промышленности. Часто она решается с помощью высушивания белка посредством различных способов высушивания, таких как высушивание замораживанием. После этого белок расфасовывают и хранят в сухом виде. Раствор перед высушиванием или высушиванием с помощью замораживания, сухой материал и вновь растворенный продукт должны быть стабильными во избежание существенной потери активности в процессе высушивания, а также во время хранения или применения.

Высушивание замораживанием является дорогостоящим и длительным процессом, поэтому при изготовлении коммерческого препарата было бы весьма, желательно избежать этого этапа. Помимо этого, пациенту перед употреблением необходимо растворять сухой белок, что может быть для него неудобным.

Гемофилия является наследственной болезнью, известной веками, однако лишь последние три десятилетия стало возможным дифференцировать различные ее формы: гемофилию А, гемофилию В и гемофилию C. Гемофилия А является наиболее распространенной формой. Она поражает только мужчин с частотой 1-2 человека на 10 000 живых новорожденных мальчиков. Заболевание вызывается сильно сниженным уровнем или отсутствием биологически активного фактора свертывания крови VIII (антигемфилического фактора), который является белком, в норме присутствующим в плазме крови. Клиническим проявлением гемофилии А является сильная склонность к кровотечениям, и до внедрения в практику лечения концентратами фактора VIII средняя продолжительность жизни этих пациентов составляла менее 20 лет. Концентраты фактора VIII, полученные из плазмы крови, стали доступными в течение трех последних десятилетий. Это значительно улучшило ситуацию с лечением гемофиликов и дало им возможность вести нормальный образ жизни.

Терапевтические концентраты фактора VIII до настоящего времени получали путем фракционирования плазмы крови. Однако в настоящее время существуют способы получения фактора VIII в культурах клеток с помощью методик рекомбинантной ДНК, как описано например, J. Gitschier и др., Nature 312, стр. 330-37, 1984 и EP-A-160 457. Концентраты фактора VIII, полученные из плазмы крови, содержат несколько фрагментированных форм с полной активностью фактора VIII (Andersson и др., Proc.Natl.Acad. Sci. USA, том 83, стр. 2979-83, май 1986). Самая малая активная форма имеет молекулярную массу 170 кДа и состоит из двух целей 90 кДа и 80 кДа, соединенных между собой ионным мостиком металла. Ссылка сделана на ЕР-А-197901. Kabi Pharmacia разработала рекомбинантный фактор VIII, который соответствует форме 170 кДа плазменного фактора VIII в терапевтических концентратах фактора VIll. Усеченная рекомбинантная молекула фактора VIII обозначается r-VIII SQ и вырабатывается клетками яичника китайского хомячка (CHO) в культуре при отсутствии в конечном пассаже сыворотки в культуральной среде.

Специфическая активность r-VIII SQ составляет примерно 15 000 ME VIII:C на мг белка.

Рекомбинантный фактор VIII SQ показан для лечения классической гемофилии. Его дозы аналогичны дозам концентратов плазменного фактора VIII.

Строение и биохимические свойства рекомбинантных продуктов фактора VIII в общих чертах описаны Kaufman в Tibtech, том 9, 1991 и в Hematology, 63, стр. 155-65, 1991. Строение и биохимические свойства r-VIII SQ описаны в WO-А-91/09122.

Фактор VIII, фракционированннй из плазмы крови, обычно продается в виде порошка, полученного при высушивании замораживанием, который необходимо разводить водой.

Препарат, содержащий небольшое количество белка, обычно теряет свою активность во время очистки, стерильного приготовления, расфасовки и применения. Эту проблему обычно решают путем добавления альбумина человека, который значительно уменьшает потерю активного белка. Альбумин человека действует как главный стабилизатор во время очистки, стерильного приготовления и высушивания замораживанием (см. обзор Wang и др., J.of Parenteral Sci. and Tech. том. 42, номер 2, приложение 1988). Применение альбумина для стабилизации фактора VIII известно, и в настоящее время он используется во всех препаратах фактора VIII высокой степени очистки, имеющихся в продаже.

Тем не менее, желательно избегать добавления альбумина человека к лекарственному белку, полученному посредством методики рекомбинантной ДНК. Помимо этого, применение альбумина, человека в качестве фармацевтического наполнителя часто ограничивает использование многих эффективных и чувствительных аналитических способов изучения белка.

Для стабилизации различных белков было предложено несколько решений. Так, ЕР 35204 (Cutter) раскрывает способ придания термостабильности белковой композиции в присутствии многоатомного спирта. Далее, WO-A-89/09614 (Genentech) раскрывает стабилизированный препарат гормона роста человека, содержащий глицин, маннитол и буфер, а в предпочтительном варианте осуществления изобретения добавлялось также неионное поверхностно-активное вещество, такое как полисорбат 80. Неионное поверхностно-активное вещество добавляли для уменьшения агрегации и денатурации. Этот препарат имел повышенную стабильность в высушенном замораживанием виде и при последующем растворении. Также, US-А-4783441 (Hoechst) раскрывает водный раствор, содержащий белок, такой как инсулин, и поверхностно-активное вещество.

ЕР 77870 (Green cross) раскрывает добавление аминокислот, моносахаридов, олигосахаридов или сахароспиртов или углеводородной карбоновой кислоты для улучшения стабильности раствора, содержащего фактор VIII. ЕР 117064 (Green cross) раскрывает добавление сахароспирта или дисахаридов к водному раствору фактора VIII для повышения стабильности во время обработки нагреванием.

WO-А-91/10439 (Octapharma) заявляет стабильный раствор фактора VIII или фактора IX для инъекций, который содержит дисахарид, предпочтительно, сахарозу, и одну или более аминокислот, а ЕР 315968 и ЕР 314095 (Rorer) заявляют стабильные препараты фактора VIII различной ионной силы.

US -А-4727027 (Diamond Scientific) направлен на способ фотохимической деконтаминации водных композиций, содержащих биологически активные белки, выделенные из крови или компонентов крови, для минимизации потерь активности. Этот способ включает в себя добавление по меньшей мере одного фурокумарина к композиции и облучение полученной композиции ультрафиолетом (УФ). Перед облучением концентрация кислорода в водной композиции может быть снижена для ингибирования денатурации. Последнее достигается, например, добавлением поглотителей кислорода, альбуминов и/или ферментных систем и/или промывкой инертным газом. Растворы, содержащие фактор VIII, промывали аргоном с аскорбатом и без аскорбата в течение периода времени до 6 часов, US-А-4727027 умалчивает о хранении растворов в течение длительного времени, а также о возможном влиянии сниженной концентрации кислорода на активность фактора VIII при таком хранении.

ЕР-А-0212040 (Immuno) относится к вирусной инактивации фактора VIII нагреванием сухого вещества в окружающей среде со сниженным содержанием кислорода. Нагревание осуществляли в отсутствии стабилизаторов, поскольку последние защищают также и вирусы, снижая, таким образом, эффективность обработки. Тесты выполняли при 90^oC в течение 30 часов, ЕР-А-0212040 умалчивает о проблеме низкой стабильности водных растворов, содержащих фактор VIII, которая обычно является гораздо более трудноразрешимой проблемой, чем низкая стабильность сухих продуктов. Это происходит благодаря химическим изменениям, например, гидролизу и дезаминированию, которые значительно больше выражены в растворе, нежели в сухом веществе.

Белки различаются между собой по своим физико-химическим свойствам. При приготовлении фармацевтического препарата, который должен быть физиологически приемлемым и стабильным в течение длительного времени, нельзя принимать во внимание только свойства белка; должны учитываться также и другие аспекты. Примерами последних являются промышленное производство, а также простота употребления и безопасность для пациентов. При испытании различных препаратов последствия этих аспектов непредсказуемы, а зачастую для каждого белка существует единственный раствор.

Применение и производство фактора VIII облегчается, если белок приготавливают и доставляют пациенту в виде стабильного раствора без добавления альбумина, обладающего длительным сроком хранения. Такой раствор облегчает также пациенту пользование конечным лекарственным продуктом. Пациент может инъецировать конечный лекарственный продукт непосредственно, без растворения.

Водные растворы, содержащие химические соединения, чувствительные к кислороду, могут быть дезоксигенированы следующим образом.

Воду для инъекций продувают азотом для снижения концентрации кислорода. Компоненты растворяют и раствор продувают азотом и хранят в атмосфере азота. Во время наполнения флаконы продувают струей азота и флаконы закрывают под струей азота. Однако дезоксигенировать белковый раствор продуванием раствора газом невозможно. Белковые растворы сильно пенятся и многие белковые лекарственные средства, такие как фактор свертывания VIII, денатурируют, если подвергаются такой обработке. Следовательно, ранее не предлагалось хранение водного раствора, содержащего фактор свертывания VIII под инертным газом, таким как азот.

Описание изобретения

Мы обнаружили, что растворы, содержащие фактор свертывания VIII, могут быть дезоксигенированы без денатурации белка. Так, к нашему удивлению, мы обнаружили, что фактор свертывания VIII можно стабилизировать без альбумина, и что такой водный раствор с низким содержанием кислорода стабилен при хранении, например, при 2-8^oC. Таким образом, настоящее изобретение относится к конечному лекарственному продукту, включающему в себя фактор VIII в водном растворе со сниженной концентрацией кислорода, для значительного сохранения активности фактора VIII при длительном хранени.

Фактор VIII может являться как плазменным фактором VIII, так и рекомбинантным фактором VIII. Когда фактор VIII является рекомбинантным, он может быть в форме с полной длиной или, предпочтительно, в виде фрагментов. Более предпочтительно, эти фрагменты являются продуктами расщепления (фрагментами) FVIII SQ (r- VIII SQ). Активность фактора VIII может составлять от 10 до 100 000 МЕ/мл, предпочтительно, от 50 до 10 000 МЕ/мл.

Фактор VIII, используемый в примерах, является высокочищенным, то есть обладает специфической активностью более 5000 МЕ/мг белка, а композиция, согласно настоящему изобретению, стабилизируется без добавления альбумина.

Концентрацию кислорода можно снизить, подвергая водный раствор воздействию атмосферы инертного газа, или сначала снижая давление, а затем вводя инертный газ. Последний процесс предпочтительно повторить в нескольких циклах. Этим способом содержание кислорода в растворе может быть уменьшено до низкого уровня без значительной потери активности фактором VIII. Содержание кислорода в растворе может быть ниже 200 частей на миллион, удобно - ниже 50 частей на миллион, предпочтительно - ниже 10 частей на миллион и наиболее предпочтительно - ниже 2 частей на миллион. Содержание кислорода в используемом контейнере может быть снижено таким же способом, предпочтительно, воздействием атмосферы инертного газа.

Конечный лекарственный продукт относится к лекарственному средству в его окончательном контейнере. Подходящими контейнерами в настоящем изобретении являются, например, флаконы, шприцы и устройства для инъекций.

Раствор хорошо сохраняется под инертным газом, таким как азот, аргон или гелий, что в большой степени поддерживает низкое содержание кислорода. Инертный газ предпочтительно является неблагородным и, наиболее предпочтительно, азотом.

Низкое содержание кислорода может в значительной степени поддерживаться путам добавления антиоксиданта к водному раствору. Так, раствор предпочтительно содержит дополнительно по меньшей мере один антиоксидант, такой как глутатион, ацетилцистеин, метионин, токоферол, бутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол или фенольные соединения. Предпочтительно, антиоксидантом является по меньшей мере одно соединение, выбранное из группы, состоящей из глутатиона, ацетилцистеина и метионина. Комплексирующие агенты, такие как ЭДТА и лимонная кислота, могут дополнительно улучшить стабильность фактора VIII.

Количество антиоксиданта зависит от выбранного соединения. Следовательно, нельзя привести общую концентрацию или количество. Важно, однако, чтобы количество антиоксиданта, если он применяется; было бы фармацевтически приемлемым количеством.

Подходящее значение pH раствора составляет от 6:6 до 8,5, предпочтительно, около 7. Предпочтительно, чтобы в растворе присутствовал неионный поверхностно-активный агент. Неионный поверхностно-активный агент, если он используется, предпочтительно выбирают из блока сополимеров, таких как полоксамер или эфир жирной кислоты и полиоксиэтилен сорбитана, такой как полисорбат 20 или полисорбат 80. Неионный поверхностно-активный агент, если он применяется, должен присутствовать в количестве более критической мицелльной концентрации (КМК). Cм. , Wan и Lee, Journal of Pharm.Sci., 63, стр. 136, 1974. Таким образом, эфир жирной кислоты и полиоксиэтилен сорбитана предпочтительно добавлять в количестве по меньшей мере 0,01 мг/мл.

Водный раствор может дополнительно содержать хлорид натрия или калия, предпочтительно в количестве более 0,1 М.

Ассоциация тяжелых и легких цепей фактора VIII зависит от присутствия кальция (или других ионов двухвалентных металлов). Здесь кальций был добавлен в виде хлорида кальция (CaCI₂), однако можно использовать другие соли, такие как глюконат кальция, глюбионат кальция или глюцептат кальция, предпочтительно, в количестве более 0,5 мМ.

Водный раствор предпочтительно содержит аминокислоту, такую как L-гистидин, лизин и/или аргинин, в количестве более 1 мМ. Можно добавить моно- или дисахариды, такие как сахароза или сахароспирты. Предпочтительно, раствор содержит L-гистидин и сахарозу.

Конечный лекарственный продукт предпочтительно включает водный раствор, содержащий:

1) 10-100 000 МЕ/мл рекомбинантного фактора свертывания VIII;

2) по меньшей мере 0,01 мг/мл эфира жирной кислоты и полиоксиэтилен сорбитана;

3) хлорид натрия, предпочтительно в количестве более 0,1 М;

4) соль кальция, такую как хлорид кальция или глюконат кальция, предпочтительно, в количестве 0,5 мМ;

5) аминокислоту, такую как L-гистидин, в количестве более 1 мМ;

6) моно- или дисахарид или сахароспирт, предпочтительно, сахарозу или маннитол.

К этому раствору может быть добавлен антиоксидант в фармацевтически приемлемом количестве.

Таким образом, конечный лекарственный продукт включает в себя стабильный водный раствор, готовый к употреблению.

Заявленный раствор может быть приготовлен с помощью способа, при котором фактор VIII свертывания крови смешивают с водным раствором или при котором фактор VIII свертывания крови элюируют водным раствором на последнем этапе очистки. Водный раствор предпочтительно содержит по меньшей мере одно добавочное вещество, выбранное из группы, состоящей из неионного поверхностно-активного агента, антиоксиданта, аминокислоты, такой как L-гистидин, соли натрия, соли кальция и сахарозы.

Настоящее изобретение относится также к способу улучшения стабильности фактора свертывания VIII в водном растворе, при котором раствор хранят под атмосферой инертного газа. Настоящее изобретение относится также к способу, благодаря которому возможно сохранить по меньшей мере 50% активности и даже 80% активности фактора VIII от первоначальной, после хранения в течение по меньшей мере 6 месяцев при температуре от 2 до 10^oC и pH раствора от 6,5 до 8,5. Используя настоящее изобретение, можно хранить лекарственный продукт, содержащий фактор VIII в водном растворе, 12 и даже 24 месяца без значительной потери активности фактором VIII. Этот способ особенно подходит для случая, когда фактор VIII представляет r-VIII SQ, поскольку данные, представленные в примерах, свидетельствуют о том, что r-VIII SQ, весьма стабилен в течение до меньшей мере 6 месяцев, если хранится под азотом при 53^oC.

Следующие примеры иллюстрируют настоящее изобретение и представляют данные по стабильности для различных водных растворов, подвергаемых воздействию азотом и аргоном, согласно настоящему изобретению, и воздухом для сравнения. Патентная охрана не ограничивается этими примерами.

Экспериментальная часть

Материалы и методы

Получение рекомбинантного фактора VIII SQ (r-VIII SQ) в основном происходило, как описано в патенте WO-A-91/09122, пример 1-3.

ДГФР-дефицитную клеточную линию CHO (DG44N.Y) электопорировали экспрессирующим вектором, содержащим ген r-VIII SQ, и экспрессирующим вектором, содержащим ген дигидрофолатредуктазы. После селекции на селективной среде выжившие колонии амплифицировали посредством роста в постепенно возрастающих количествах метотрексата. Надосадочную жидкость с полученных в результате колоний индивидуально исследовали на активность фактора VIII. Был выбран продуктивный клон и адаптирован к суспензионному росту на среде определенного состава, не содержащей сыворотки, в результате чего был разработан широкомасштабный ферментативный процесс. Надосадочную жидкость собирали через определенные промежутки времени и затем очищали, как описано ниже.

Осветленной кондиционированной среде придавали определенное значение pH и помещали на колонку с S-сефарозой FF. После отбывания фактор VIII элюировали солевым буфером, содержащим 5 мМ CaCl₂. Иммуносорбцию выполняли на иммуноаффинной смоле, в которой лигандом служило моноклональное антитело (8А4), направленное против тяжелой цепи фактора VIII. Перед загрузкой на колонку S-элюат обрабатывали 0,3% ТНБФ и 1% Октоксинолом 9. Колонку уравновешивали, отмывали и фактор VIII элюировали буфером, содержащим 0,05 М CaCl₂ и 50% этиленгликоля.

mAb - элюат загружали на колонку с Q-сефарозой FF, уравновешивали элюирующим буфером на иммуноаффинном этапе. После отмывания фактор VIII элюировали 0,05 М L-гистидином, 4 мМ CaCl₂, 0,6 М NaCl, pH 6,8.

Q-элюат помещали в гель-фильтрационную колонку (Superdex 200 p.g.). Уравновешивание и элюция выполнялись буфером, согласно рецептуре препарата, в результате чего получали композицию, согласно нижеследующим примерам.

Объем материала r-VIII SQ получали после конечного этапа очистки. Активность фактора VIII и концентрацию неактивных компонентов доводили до желаемых путем разведения соответствующим буфером. Раствор затем стерилизовали фильтрованием (0,22 мкм), расфасовывали и дезоксигенировали путем помещения раствора, в условия пониженного давления и последующего введения инертного газа несколькими циклами.

Активность фактора свертывания VIII оценивали посредством хромогенного субстратного анализа. (Coatest Factor VIII, Chromogenis AB, Moindal, Sweden). Активированный фактор X (Xa) вырабатывается посредством внутреннего метаболического пути, когда фактор VIII действует как кофактор. Фактор X_a затем определяли путем использования синтетического хромогенного субстрата, S-2222, в присутствии ингибитора тромбина 1-2581 для предотвращения гидролиза субстрата тромбином. Реакцию останавливали кислотой, a VIII:C, которая пропорциональна высвобождению пНА (пара-нитроанилина), определяли фотометрически на 450 нм в сравнении с контролем - реагентом. Единицу фактора VIII: C выражали в международных единицах (ME), как определено действующим в настоящее время международным стандартом (МС) концентраций, установленным BOЗ.

Пример 1. Сравнение растворов при хранении в атмосфере азота иди воздуха.

Рекомбинатный фактор VIII получали как описано в разделе "Экспериментальная часть". Растворы хранили при трех разных температурах: 7, 25 и 30^oC, соответственно. Объем расфасованного препарата во флаконах составлял 2 мл (табл. 1)

Из этого примера ясно, что отсутствие кислорода при 7^oC дает приемлемую потерю VIII:C спустя 6 месяцев при хранении в виде раствора. Даже при 25 или 30^oC раствор, согласно настоящему изобретению, может храниться без слишком большой потери активности. Далее, можно видеть, что стабильность была лучше при pH 7, чем при pH 6.

Пример 2. Растворы, содержащие антиоксидант и сахарозу

Рекомбинантный фактор VIII получали как описано в разделе "Экспериментальная часть". Растворы хранили при двух разных температурах, 7 и 25^oC, соответственно. Объем расфасованного препарата во флаконах составлял 2 мл (табл.2).

Оба раствора продемонстрировали приемлемую стабильность VIII:C спустя шесть месяцев при 7^oC.

Пример 3. Сравнение растворов, содержащих глутатион или аскорбиновую кислоту, и хранящихся в атмосфере воздуха или азота.

Рекомбинантный фактор VIII получали, как описано в разделе "Экспериментальная часть". Растворы хранили при температуре 25^oC. Объем расфасованного препарата во флаконах составлял 2 мл (табл. 3).

Спустя 2 месяца хранения под атмосферой азота активность фактора VIII сохранялась на уровне приблизительно 80% от начальной величины или более. Это наблюдалось безотносительно к присутствию или отсутствию глутатиона. Однако глутатион значительно повышал стабильность при хранении раствора под атмосферным воздухом. Аскорбиновая кислота снижала стабильность фактора VIII.

Пример 4. Сравнение растворов с глутатионом и без глутатиона, хранившихся под аргоном или атмосферным воздухом

Рекомбинантный фактор VIII получали, как описало в разделе.

"Экспериментальная часть". Растворы хранили при двух разных температурах, 7 и 25^oC, соответственно. Объем расфасованного препарата во флаконе составлял 2 мл (табл. 4).

Спустя 6 месяцев хранения под аргоном, активность фактора VIII сохранялась на уровне приблизительно 65% или более от начальной величины при температуре хранения 25^oC. После хранения при температуре 7^oC соответствующая величина составляла 80% или более.