способ определения конъюгированной фракции кортизола в моче

Формула изобретения

Способ определения конъюгирования фракции кортизола в моче с использованием ферментативного гидролиза - глюкуронидазой, отличающийся тем, что из суточного количества нативной мочи отбирают 0,5 - 1 мл, кипятят в течение 1 мин, охлаждают и добавляют к пробе равное количество раствора -глюкуронидазы в ацетатном буфере с рН 4,5 из расчета 500 МЕ активности фермента на мл мочи, проводят гидролиз при температуре 37^oC в течение 18 - 20 часов, отливают супернатант гидролизата и смешивают его и параллельно пробы нативной мочи с эфиром в соотношении 1 : 10 - 1 : 30, экстрагируют смесь в течение 30 - 120 секунд, затем после удаления водной фракции и эфира сухой остаток разбавляют фосфатным буфером с рН 7,2 - 7,4 с доведением объема до первоначального, нагреват в течение 5 мин при температуре не выше 60^oC, охлаждают и добавляют раствор меченного 1 125 кортизола и раствор специфических к кортизолу антител, после чего полученную пробу инкубируют при температуре 18 - 25^oC в течение 1 - 4 часов, добавляют преципитирующий реагент, содержащий вторые антитела к кортизолу, и центрифугируют в течение 10 - 30 минут при ускорении 1500 - 2000 g и температуре 18 - 25^oC с последующим удалением супернатанта, и в полученном осадке измеряют уровень -излучения, после чего подсчитывают радиоактивность по калибровочному графику, с учетом разведения и суточного диуреза в пробе гидролизованной мочи вычисляют показатель суточной экскреции суммарного кортизола, в пробе нативной мочи - показатель суточной экскреции свободного кортизола, при этом показатель содержания конъюгированной фракции кортизола получают вычитанием из показателя суточной экскреции суммарного кортизола показателя суточной экскреции свободного котизола.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к эндокринологии, а именно к лабораторным способам определения кортикостероидов в моче.

Известен способ определения суммарных и конъюгированных фракций глюкокортикоидов в моче по модифицированному методу Сильбера-Портера.

(Silber R.H., Porter C.C. Determination of 17,21 -dihydroxy - 20- ketosteroids in urine and plasma. - J. Biol. Chem., 1954, 210, N 2, p. 923-932).

Метод основан на определении суммарных, т.е. конъюгированных с глюкуроновой кислотой, и свободных 17-оксикортикостероидов. Для определения суммарной фракции мочу перед экстракцией обрабатывают b-глюкуронидазой, расщепляющей глюкурониды, а определение свободных 17-ОКС производится из нативной мочи. 17-ОКС экстрагируют хлороформом и количественно определяют по цветной реакции с фенилгидразином.

Данный способ принят нами за прототип.

Однако он обладает рядом недостатков:

1. Чувствительность определения достаточно низка и составляет около 15 мкг в пробе, оптимальный диапазон колеблется от 1,5 до 30 мкг.

2. Определяемые данным методом хромогены Портера-Сильбера составляют только около 40% всех продуктов обмена гидрокортизона.

3. Присутствие в моче билирубина, аскорбиновой кислоты, некоторых лекарственных препаратов и красящих веществ, содержащихся в пищевых препаратах (свекла, апельсины, морковь и т.д.) искажает результаты анализов.

4. Определяемые данным методом неконъюгированные свободные 17-ОКС составляют 1-6% от суммарного количества.

5. Данный метод трудоемок, требует большого количества перегнанных в условиях лаборатории токсических органических растворителей, вредно влияющих на организм исследователя.

Целью изобретения является повышение специфичности и чувствительности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения конъюгированных фракций кортизола в моче с использованием - глюкуронидазы, гидролизованную мочу смешивают с эфиром в соотношении 1:10 - 1:30, осуществляют экстракцию в течение 30-120 секунд. После удаления водной фракции высушивают эфирный остаток, который в последующем разбавляют фосфатным буфером pH 7,2-7,4 и полученную пробу инкубируют от 1 до 4 часов при комнатной температуре со специфическими антителами и раствором меченного 1 125 кортизола. Добавлением преципитирующего реагента, содержащего вторые антитела к кортизолу, и центрифугированием в течение 10-30 минут при ускорении 1,5-2 тыс. g при температуре 18-25^oC осуществляют разделение на свободный и связанный с антителами кортизол. По калибровочному графику определяют количество конъюгированной фракции кортизола. Расчет проводится с учетом разведения, времени и количества экскретируемой мочи и концентрации кортизола, определяемого из нативной мочи с помощью вышеназванной реакции антиген-антитело.

Для реализации предложенного способа нами были выбраны следующие оптимальные параметрические значения:

Из суточного количества мочи берется 0,5-1 мл и кипятится в течение 1 минуты для удаления ингибитора - глюкуронидазы в пробе.

К моче добавляют равное количество раствора - глюкуронидазы в ацетатном буфере pH 4,5 из расчета 500 ед. активности мл, тщательно перемешивают и ставят в термостат при 37^oC на 18-20 часов.

Пробы после гидролиза центрифугируют, из супернатанта отбирают 50 мкл гидролизата и осуществляют экстракцию эфиром в соотношении 1:10-1:30. При добавлении эфира в соотношении менее 1:10 нельзя быть уверенным в полной экстракции кортизола, а при добавлении эфира в соотношении более 1:30 неадекватно увеличивается объем реакционной смеси.

Экстракцию осуществляют в течение 30-120 секунд на вортекс-экстракторе. При экстрагировании менее 30 сек не достигается максимум экстракции кортизола, а при удлинении времени экстракции свыше 120 секунд невозможно избежать потерь некоторого количества эфира, что приводит к изменению объема реакционной смеси.

Для вымораживания водной фазы пробы помещают в жидкий азот (можно использовать любой способ, позволяющий быстро заморозить водную фазу). Эфирный экстракт переносят в чистые пробирки и выпаривают при температуре не выше 60^oC во избежание температурного разрушения кортизола.

К сухому остатку добавляют 50 мкл фосфатного буфера pH 7,2-7,4 (оптимальный pH для достижения равновесия в реакции антиген-антитело), тщательно перемешивают и прогревают пробы в водяной бане в течение 5 минут при температуре не выше 60^oC. В пробу добавляют раствор антигена - меченый 1 125 кортизол (удельная активность - 100 мккюри мг) в количестве 100 мкл.

Затем добавляют раствор специфических антител в количестве 100 мкл (процент связывания антител с антигеном не менее 80%, максимум 100%).

Пробы тщательно перемешивают и инкубируют при температуре 18-25^oC в течение 1-4 часов. При инкубировании менее 1 часа не достигается равновесие реакции антиген-антитело, а при увеличении более 4 часов необходимо подбирать более низкий температурный режим во избежание сдвига равновесия в реакции антиген-антитело. При проведении инкубации при температуре менее 18^oC нецелесообразно удлиняется время проведения реакции, а при температуре более 25^oC может нарушиться процесс установления равновесия антиген-антитело.

Для отделения свободного антигена от связанного с антителами кортизола добавляют 800 мкл преципитирующего реагента, содержащего вторые антитела и после быстрого и тщательного перемешивания центрифугируют в течение 10-30 минут при ускорении 1,5-2 тыс. g при комнатной температуре. При меньшем времени центрифугирования (менее 10 минут) можно получить недостаточное разделение свободной и связанной с антигеном фракций, а при более длительном центрифугировании (более 30 минут) может нарушиться связь между антигеном и меткой. Ускорение при центрифугировании менее 1,5 тыс g приведет к неполному разделению свободного антигена и связанного комплекса, а увеличение ускорения свыше 3 тыс g приведет к осаждению более мелких молекул, чем комплекс антиген-антитело.

В осадке измеряют уровень гамма-излучения. Параллельно проводят реакцию антиген-антитело со стандартными растворами кортизола, концентрации стандартов от 43 нмоль/л до 2760 нмоль/л.

В ходе разработки и налаживания метода определения свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче с помощью 1 125 проводилась оценка воспроизводимости результатов определения фракций кортизола в контрольных образцах мочи при различных условиях проведения методики, но в пределах, указанных выше. Полученные результаты подтвердили правильность выбранных оптимальных параметрических значений.

Новым в предлагаемом способе является переход определения концентрации суммарных кортикостероидов с химического метода на высокоспецифичный радиоиммунологический метод определения кортизола в моче, что позволяет в конечном итоге оценить количественно экскрецию с мочой свободной и конъюгированной фракций кортизола. Высокая чувствительность предлагаемого способа позволяет установить более точные показатели экскреции с мочой кортизола по сравнению с классическим методом Сильбера-Портера.

Существо изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Больной К.В.А., 1953 г.р., история болезни N 2093, находится в отделении терапевтической эндокринологии с 11.02.1994 по 25.03.1994.

Диагноз: хроническая надпочечниковая недостаточность медикаментозно субкомпенсированная с периодическими надпочечниковыми кризами (двухсторонняя адреналэктомия в 1980 и 1982 годах, лучевая терапия на межуточно-гипофизарную область в 1976, 1977 и 1987 гг по поводу болезни Иценко-Кушинга).

19.01.94 б-ной обследовался в предкризовом состоянии амбулаторно. Суточная экскреция мочи составила 2 л, содержание суммарных 17-ОКС-6 (при норме 8 - 24) мкмоль/л сутки, кортизола крови - 198 (при норме 190-750) нмоль/л. 14.02.94 б-ной обследовался в период острой надпочечниковой недостаточности, но после назначения глюкокортикоидов. В этот период диурез составил 1,7 л мочи в сутки, экскреция 17-ОКС - 10 мкмоль/л сут, содержание кортизола крови - 52 нмоль/л, содержание АКТГ в плазме крови - 52,8 (при норме 2,2 - 13,2) пмоль/л, что подтверждает диагноз надпочечниковой недостаточности.

В эти же сроки проводилось определение содержания в моче свободной и конъюгированной фракции кортизола.

Для определения суммарной фракции кортизола из суточного количества мочи отобрали 500 мкл, пробирки с мочой поместили в кипящую водяную баню на 1 минуту, охладили, добавили 500 мкл раствора - -глюкуронидазы в ацетатном буфере и ставили на гидролиз в термостат при 37^oC на 18 часов. Затем в стеклянные пробирки вносили 50 мкл мочи, к которым добавляли 500 мкл эфира и осуществляли экстракцию кортизола на вортекс-экстракторе (смешиватель вибрационный СВ-3, Россия) в течение 60 секунд. Затем пробы помещали в жидкий азот до замерзания водной фазы, эфирную фазу переносили в сухие стеклянные пробирки и выпаривали в защищенном от прямых солнечных лучей вытяжном шкафу досуха. Затем добавляли 50 мкл фосфатного буфера pH 7,4, тщательно перемешивали и прогревали на водной бане при температуре 60^oC. После охлаждения до комнатной температуры добавляли 100 мкл меченного I 125 кортизола и 100 мкл раствора антисыворотки (оба компонента берутся из тест-системы для определения кортизола в сыворотке крови человека СТЕРОН-К-I125-М Опытного производства ИБОХ АН Республики Белорусь, оба компонента разделяются фосфатным буфером в соотношении 1:2 по сравнению с исходным разведением в вышеназванной тест-системе). Пробы тщательно перемешивали на вортекс-миксере (фирма LKB, Швеция) и инкубировали в течение 2 часов при температуре 18 - 25^oC. После этого добавляли преципитирующий реагент в количестве 1 мл (преципитирующий реагент из тест-системы СТЕРОН-К-I125-М), тщательно перемешивали на миксере до получения однородной смеси и центрифугировали при 2.0 тыс. g в течение 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования удаляли надосадочную жидкость, а пробирки с осадком помещали в гамма-счетчик для подсчета радиоактивности в течение 1 минуты (гамма-800, ВНИИМП, производство Россия). Для количественной оценки содержания конъюгированных фракций кортизола в моче определяли тотальную активность 100 мкл меченного I 125 кортизола. Параллельно проводили построение калибровочного графика со стандартными спиртовыми растворами кортизола в концентрациях 0; 42,9; 85,8; 171,8; 343,8; 687,5; 1375; 2750 нмоль/л, (0; 15,6; 31,2; 62,5; 125; 250; 500; 1000 нг/мл). В пробирки со стандартами добавляли 100 мкл меченого кортизола, 100 мкл раствора антисыворотки и проводили остальные этапы аналогично вышеописанному определению содержания суммарного кортизола в моче. На основании показателей радиоактивности в стандартных пробах строили калибровочный график относительно концентрации нулевого стандарта (Bo). (см. рис. 1) На основании данного определения содержание суммарного кортизола в моче в пробе от 19.01.94 составило 11 нг/мл, от 14.02.94 - 23 нг/мл. Для определения конъюгированной фракции кортизола в моче параллельно определяли содержание свободной фракции кортизола в моче. Для этого из суточного количества мочи берется 50 мкл, экстрагируется эфиром, эфирная фракция помещается в сухую пробирку и дальнейшие этапы соответствуют вышеописанным. После подсчета радиоактивности по калибровочному графику определяли содержание свободного кортизола в данных пробах. В пробе от 19.01.94 содержание кортизола соответствовало 8 нг/мл, а в пробе от 14.02.94 - 12 нг/мл. С учетом разведения и суточного диуреза вычисляли суточную экскрецию суммарного и свободного кортизола нмол/л сутки:

суммарный кортизол - свободный кортизол

19.01.94

11(нг/мл)2 (разведение) 2(л, диурез) 2.75 (пересчет в молярность)= 121 нмоль/л сут - 8(нг/мл) 2 (л, диурез)2.75 (пересчет в молярность)= 44 нмоль/л сут

14.02.94

2321.72.75 = 215 нмоль/л сут - 121.72.75= 56 нмоль/л сут.

Далее из показателя суточной экскреции суммарного кортизола вычитали показатель суточной экскреции свободного кортизола и получили показатель содержания конъюгированной фракции кортизола в моче. От 19.01.94 он составил 121-44=77 нмоль/л сут, а от 14.02.94.215-56 159 нмоль/л сут.

Пример 2. Обследуемая Д.Ю.А., 1970 г.р., клинический диагноз: практически здорова. Определение суточной экскреции суммарной, свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче проводилось по вышеописанной методике в аналогичных условиях.

Результаты определения, 4.10.93:

Диурез - Фракции кортизола, (нмоль/л сут)

1 л - суммарная 364 - свободная 157 - конъюгированная 207

Пример 3. Больная С.Н.В., 1956 г.р., история болезни N 11827, находилась в отделении хирургической эндокринологии с 7.09.93 по 19.10.93. В анамнезе перенесен гепатит.

Диагноз при поступлении: Болезнь Иценко-Кушинга, кортикостерома левого надпочечника.

7.10.93 левосторонняя адреналэктомия, удалена смешаноклеточная аденома коры надпочечника.

Определение суточной экскреции суммарной, свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче проводилось по вышеописанной методике в аналогичных условиях.

Обследование до операции:13.09.93 17-ОКС - 25 мкмоль/л сут (норма от 8 до 24) 8.09.93 кортизол крови 1308 нмоль/л (норма от 190 до 750)

Фракции кортизола (нмоль/л сут):

13.09.93 свободная 265, конъюгированная 679, суммарная 944

Обследование после операции:

4.10.93. кортизол крови 897 нмоль/л

18.10.93 кортизол крови 591 нмоль/л

16.03.1994 обследована после операции, амбулаторно, подтвержден рецидив заболевания.

17-ОКС-22 мкмоль/лсут, кортизол крови 315 нмоль/л,

Фракции кортизола (нмоль/л сут): свободная 348, конъюгированная 2020, суммарная 2368

Предложенный способ определения конъюгированной фракции кортизола в моче обладает рядом преимуществ по сравнению с химическим методом Сильбера-Портера, он позволяет:

1. повысить специфичность метода определения кортизола в моче;

2. повысить чувствительность указанного метода,

3. устранить дополнительные трудоемкие методы очистки и выделения кортикостероидов из мочи;

4. избежать использования в больших количествах высокотоксичных органических растворителей;

5. повысить не менее, чем в три раза производительность труда по сравнению с методом Сильбера-Портера.

В настоящее время происходит накопление клинического материала. С использованием разработанной методики проводится определение различных заболеваний надпочечников, находящихся в отделении хирургической эндокринологии, и соответствующих амбулаторных больных Проводится сравнительный анализ свободной и конъюгированной фракций кортизола в моче, полученных вышеописанным способом, с суммарными 17-оксикетостероидами и с кортизолом сыворотки, полученным радиоиммунным способом. Полученные данные приведены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить свободную, связанную и суммарную экскрецию кортизола, и может быть использован для дифференциальной диагностики заболеваний надпочечников, а также при назначении глюкокортикоидов с лечебной целью.

Построение калиброванного графика дано на рис. 1.

Наименование проб СРМ B/B₀x100%

T Тотальная активность 16093

B₀ Стандарт 0 нг/мл 13936

B₁ Стандарт 15,6 нг/мл 9923 71%

B₂ 31,2 нг/мл 8483 61%

B₃ Стандарт 62,5 нг/мл 7302 52%

B₄ Стандарт 125 нг/мл 5574 40%

B₅ Стандарт 250 нг/мл 4000 29%

B₆ Стандарт 500 нг/мл 2838 20%

B₇ Стандарт 1000 нг/мл 1827 13%

Рассчитываем максимальную связывающую активность антител: B₀T 100% = 13936/16093 100% = 86,6%.

Строим калибровочный график зависимости B/B₀100% от концентрации стандартных растворов кортизола в этих пробах (нг/мл).