имидазолсодержащие ингибиторы катепсин g-индуцированной агрегации тромбоцитов

Формула изобретения

Применение имидазолсодержащих соединений общей формулы



где при R₁ CH₃-(CH₂)₁₀-CONH- R₂ H-, а при R₁ NH₂- R₂ -COOCH₃,

в качестве ингибиторов катепсин G-индуцированной агрегации тромбоцитов.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к биохимии крови, регуляции системы гемостаза, а именно к новым низкомолекулярным синтетическим ингибиторам тромбообразования.

Катепсин G представляет собой сериновую протеазу, которая выделяется активированными лейкоцитами при воспалительных заболеваниях и обладает антимикробными свойствами. Однако эта протеаза является мощным индуктором агрегации тромбоцитов, что может привести к тромботическим осложнениям при воспалительных заболеваниях. Поэтому поиск новых ингибиторов катепсин-G-индуцированной активации тромбоцитов актуален для решения проблем контроля гемостаза и борьбы с тромботическими осложнениями при воспалении и инфекциях.

Наибольший интерес в этом отношении представляют низкомолекулярные соединения с простым способом получения.

Известны низкомолекулярные ингибиторы тромбообразования, представляющие собой модифицированные простациклины, теофилины и три-тетрапептиды, однако они не ингибируют катепсин-G-индуцированную агрегацию тромбоцитов.

Наиболее близким по действию к заявляемым соединениям является ингибитор катепсина G-эглин. Последний представляет собой низкомолекулярный белок, состоящий из 70-и аминокислот, выделенный из пиявок Hirudo medicinalis. Недостатком этого ингибитора является подавление исключительно протеазной активности, но не индуцированной катепсином G агрегации тромбоцитов. Кроме того, процесс выделения эглина из природного источника пиявок сложен, многостадиен, (включая многократную колоночную и гель-хроматографии) и энергоемок вследствие необходимости многократной лиофилизации белка.

Нами предлагаются новые низкомолекулярные ингибиторы катепсина G общей формулы (I), обладающие способностью подавлять тромбообразование, с простым способом их получения.

Общая формула (I):



где при R₁ CH₃(CH₂)₁₀-CONH- R₂ H-,

а при R₁ NH₂- R₂ -COOCH₃.

Конкретно предлагаемые вещества представляют собой дихлоргидрат метилового эфира гистидина (H-His-OMe2HCl) и N-лауроилгистамин (Lau-HA). Дихлоргидрат метилового эфира гистидина получают этерификацией гистидина метиловым спиртом в кислой среде и выпускается рядом фирм, производящих химические реактивы для пептидного синтеза. N-лауроилгистамин получают ацилированием гистамина хлорангидридом лауриновой кислоты в органическом растворителе с высоким выходом и следующими константами: Т. пл. 121-125^oC. ИК-спектр в вазелиновом масле, см^-1: 1570 (амид I), 1460 (амид II), ¹H-ЯМР (CD₃OD), d м. д. 0,92 (т, 3Н, w -CH); 1,30 (м, 16Н, 8*CH₂); 1,56 (т, 2H, b-CH₂); 2,17 (т, 2Н, a-CH₂); 2,92 (т, 2Н, a-CH₂-HA); 3,50 (т, 2Н, b-CH₂-HA); 7,30 (c, 1H, CH-4-Im); 8,80 (c, 1H, CH-2-Im). Найдено, С 69,67; H 10,57; N 14,29. C₁₇H₃₁N₃O. Вычислено, С 69,52; H 10,56; N 14,31.

Катепсин G был выделен из нейтрофилов периферической крови человека по методу, описанному ранее. Катепсин G и тромбин (Sigma) были использованы в качестве индукторов агрегации тромбоцитов. Тромбоциты выделяли из венозной крови методом центрифугирования. В качестве антикоагулянта был использован 3,8%-ный водный раствор цитрата натрия в соотношении 1 9 с кровью. Среда для суспендирования тромбоцитов содержала HEPES-буфер 10 мМ, NaCl 150 мМ, KCl 2,7 мМ, NaH₃PO₄ 0,37 мМ, MgCl₂ 1 мМ, CaCl₂ 1 мМ, глюкозы 5 мМ, pH 7,4 с аспиразой 0,1 мг/мл. Число тромбоцитов в исследуемых пробах составляло 310 в 1 мл. Агрегацию тромбоцитов в суспензии регистрировали на двухканальном агрегометре Labor APACT, Hamburg. Содержание в тромбоцитах цитоплазматического Ca ([Ca]цит) определяли с помощью флуоресцентного кальциевого зонда Fura-2AM, Calbiochem, USA флуориметрическим методом [10] Флуоресценцию регистрировали на спектрофлуориметре Hitachi-3000, Japan. Статическую обработку проводили, используя критерий Стьюдента.

Катепсин G в диапазоне концентраций 0,1 мкМ -10,0 мкМ вызывал развитие прямой дозозависимой агрегации тромбоцитов, которая по форме кривой, величинам амплитуды и максимальной скорости была близка к агрегации клеток, вызванной тромбином (1,0 ед/мл) (см. таблицу). Исходя из этого, при изучении влияния HisOMe2HCl и LauHA на активированные тромбоциты, катепсин G и тромбин использовались в вышеуказанных концентрациях. В контрольной серии экспериментов была проведена оценка влияния HisOMe2HCl и LauHA на функциональное состояние неактивированных тромбоцитов. Опыты показали, что HisOMe2HCl (0,001 мМ 1,0 мМ), равно как и LauHA (0,001 мМ-1,0 мМ) не вызывали развития агрегации тромбоцитов в течение 15-минутной инкубации. Добавление HisOMe2HCl в суспензию тромбоцитов за 5 мин до их стимуляции катепсином G или тромбином препятствовало агрегации клеток. Наиболее выраженный ингибирующий эффект отмечался при использовании максимальной из исследованных концентраций HisOMe2HCl, составляющий 1 мМ. HisOMe2HCl полностью подавлял развитие катепсин- G-индуцированной агрегации тромбоцитов, вызванной тромбином, на фоне HisOMe2HCl снизилась менее значительно, в среднем на 58% (P<0,01) и 46% (P<0,05) соответственно. Следует отметить, что тромбин-индуцированная агрегация тромбонов в условиях инкубации с HisOMe2HCl имела двухволновую форму в отличие от одноволновой в контрольной серии экспериментов (в отсутствии HisOMe2HCl). Уменьшение концентрации HisOMe2HCl до 0,1 мМ, а также времени инкубации тромбоцитов до 2 мин снижало величину его ингибирующего влияния на катепсин G-, так и тромбининдуцированную агрегацию клеток. LauHA в концентрации 1 мМ также подавлял развитие агрегации тромбоцитов, вызванный катепсином G. Так после 5-минутной инкубации тромбоцитов с LauHA амплитуда катепсин-G-индуцированной агрегации снижалась на 43% (P<0,01), а максимальная скорость на 56% (P<0,01). Величина ингибирующего влияния LauHA на агрегацию тромбоцитов, стимулированных катепсином G, в зависимости от времени инкубации (от 2 до 10 мин) достоверно не изменялась. В то же время нами не было отмечено достоверного снижения показателей агрегации тромбоцитов, индуцированной тромбином, на фоне LauHA. В этих условиях имела место лишь тенденция к снижению амплитуды агрегации в среднем на 16%

Можно считать, что предлагаемые ингибиторы тромбоцитарной активности, индуцированной катепсином G, обладают прямыми антитромбоцитарными свойствами в отличие от антипротеазных свойств эглина. По сравнению с эглином предлагаемые нами ингибиторы являются более простыми для получения. Кроме того, LauHA позволяет селективно ингибировать катепсин- G-индуцированную агрегацию тромбоцитов, не оказывая влияния на тромбинстимулированное тромбообразование. HisOMe2HCl полностью подавляет катепсин-G-индуцированную агрегацию тромбоцитов, ингибируя в то же время и тромбининдуцированное тромбообразование. Предлагаемые ингибиторы могут найти применение в качестве реагентов для выяснения механизмов нарушения гемостаза, а также в качестве лекарственных фармакологических препаратов, препятствующих тромбообразованию, особенно при инфекционных и воспалительных заболеваниях.