способ получения метилового эфира n-бензилоксикарбонил-l- аспартил-l-фенилаланина

Формула изобретения

Способ получения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина путем конденсации N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L- или D,L-фенилаланина, взятых как в индивидуальном виде, так и в составе реакционных смесей, в присутствии металлопротеиназы с последующим выделением целевого продукта путем добавления раствора кислоты, отличающийся тем, что раствор кислоты добавляют непосредственно к реакционной смеси, образовавшейся после завершения реакции конденсации.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к области пептидной химии, в частности к способу получения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина - предшественника дипептида аспартама.

Аспартам является интенсивным подсластителем. Его используют в медицине: для питания больных, страдающих диабетом и ожирением; в пищевой промышленности: для изготовления соков, джемов, мороженого, при производстве молочных изделий; в фармацевтической промышленности: в облатках лекарств; в парфюмерной промышленности: для изготовления кремов, губной помады, зубных элексиров и т.д.

Способ получения целевого продукта включает в себя стадии его синтеза и последующего осаждения в свободном состоянии.

Среди многочисленных способов синтеза предшественника аспартама наиболее перспективен ферментативный [1-3] основанный на реакции конденсации N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты с метиловым эфиром L- или D, L -фенилаланина, катализируемой металлопротеиназами различных микроорганизмов.

Образующаяся в результате реакции соль дипептида (метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L- или D, L-фенилаланина выпадает в осадок, который отделяют от реакционной смеси фильтрованием и подвергают разложению в кислой среде с целью получения свободного метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина. Такой способ является ближайшим аналогом заявляемого изобретения.

Разложенные соли по способу-прототипу проводят в водной или водно-органической среде в присутствии неорганических (HCl) или органических (HCOOH, CH₃COOH и др.) кислот. Образующийся метиловый эфир N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина выпадает в осадок, его выделяют из реакционной среды фильтрованием либо экстракцией этилацетатом или хлористым метиленом. Выход целевого продукта не превышает 77% в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту.

К недостаткам способа-прототипа следует отнести трудность его осуществления в промышленном масштабе из-за высокой вязкости и обусловленной ею плохой транспортабельности реакционной смеси, содержащей соль дипептида и метилового эфира L- или D, L -фенилаланина.

Задача настоящего изобретения разработка технологически более простого и удобного для использования в промышленных условиях способа получения целевого продукта метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспаратил-L-фенилаланина.

Сущность изобретения состоит в том, что метиловый эфир N-бензилоксикарбонил-L-фенилаланина, синтезируемый конденсацией N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты с метиловым эфиром L или D, L-фенилаланина в присутствии металлопротеиназы, осаждают добавлением к реакционной смеси водного раствора кислоты.

Ферментативный синтез метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина осуществляют конденсацией N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L- или D, L-фенилаланина, взятых в индивидуальном виде или в составе реакционных смесей, полученных соответственно при обработке L-аспарагиновой кислоты N-бензилоксикарбонил-хлоридом в щелочной среде и при этерификации L- или D, L-фенилаланина метиловым спиртом. В качестве катализатора реакции образования пептидной связи используют металлопротеиназу.

Для получения метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина к реакционной смеси добавляют водный раствор кислоты (до pH 1,5-2,0) и выпавший осадок отделяют фильтрованием.

Полученный осадок анализируют методом офВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографии). Содержание основного вещества в осадке не менее 95% на сухой вес. Выход метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина в расчете на взятую в реакцию N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту до 92%

Пример 1. Получение метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина путем конденсации N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира D, L-фенилаланина, взятых в составе реакционных смесей.

Стадия 1. Получение N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты.

50 г (376 моль) L-аспарагиновой кислоты суспендируют при перемешивании на магнитной мешалке в 200 мл дист. воды (pH суспензии 2,3). Из капельной воронки добавляют 50%-ный раствор NaOH до pH 10,5-11 (расход раствора NaOH 55 мл). При этом происходит растворение L-аспарагиновой кислоты. К этому раствору при комнатной температуре (18-25^oC) и при поддержании значения pH на том же уровне в течение 3 ч при постоянном перемешивании из капельной воронки прибавляют 61 мл (406 ммоль) N-бензилоксикарбонилхлорида. После окончания прибавления всего количества N-бензилоксикарбонилхлорида реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при 18-25^oC, а затем в течение еще 6 ч при 46-48^oC, поддерживая значение pH на том же уровне. Затем реакционную смесь фильтруют через двойной бумажный складчатый фильтр. Выход синтеза N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты, рассчитанный по данным аминокислотного анализа и офВЭЖХ, составляет 95% Содержание незамещенной L-аспарагиновой кислоты составляет 5% от исходного.

Стадия 2. Получение хлоргидрата метилового эфира D, L-фенилаланина.

21,4 мл метанола и 8,12 г (48,8 ммоль) D, L-фенилаланина загружают в колбу, помещают в ледяную баню и охлаждают при перемешивании в течение 25-35 мин до температуры 7^oC. Затем при той же температуре из капельной воронки прибавляют порциями в течение 0,5-1 ч 3,48 мл (48,96 ммоль) хлористого тионила. После прибавления всего количества хлористого тионила колбу извлекают из ледяной бани и нагревают реакционную смесь при перемешивании в течение 1,5-2 ч до температуры кипения (около 64^oC), присоединив обратный холодильник, после чего ведут кипячение реакционной смеси в течение 6 ч. Затем реакционную смесь охлаждают и упаривают под вакуумом. Выход хлоргидрида метилового эфира D, L-финилаланина, рассчитанный по данным аминокислотного анализа, составляет 95% Содержание свободного D, L-фенилаланина составляет 5% от исходного.

Стадия 3. Получение метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина.

К полученному на стадии 2 продукту, содержащему 9,97 г (46,4 ммоль) хлоргидрата метилового эфира D, L-фенилаланина и 5% свободного D, L-фенилаланина добавляют 101 мл дист. воды, а затем при перемешивании небольшими порциями прибавляют аликвоту реакционной смеси со стадии 1 (15,3 мл), которая содержит 21,1 ммоль N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и 5% незамещенной L-аспарагиновой кислоты. Для поддержания pH смеси в диапазоне 6,0-6,2 добавляют при необходимости 10%-ный раствор едкого натра (не более 2 мл), затем медленно всыпают 544 мг препарата фермента металлопротеиназы B. megaterium. Синтез ведут при температуре бани 26-28^oC в течение 22-24 ч.

Затем к реакционной среде при перемешивании добавляют 4,2 мл З М HCl, достигая значения pH 1,3-2,0, и продолжают перемешивание в течение 30 мин. Образующийся при этом осадок метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина отделяют фильтрованием. Выход конечного продукта составляет 90% в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту.

Пример 2. Получение метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина путем конденсации N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и метилового эфира L-фенилаланина, взятых в составе реакционных смесей.

То же, что в примере 1, но на стадии 2 из L-фенилаланина получают хлоргидрат метилового эфира L-фенилаланина, который затем используют в реакции конечного продукта. Выход метилового эфира L-фенилаланина на стадии 2 составляет 95% при содержании свободного L-фенилаланина 5% от исходного. Конечный продукт метиловый эфир N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина получают с выходом 92% в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту.

Пример 3. Получение метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина путем конденсации индивидуальных препаратов N-бензилоксикарбонил-L-фенилаланина в присутствии металлопротеиназы B. megaterium.

13,35 г (50 ммоль) N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты суспендируют при интенсивном перемешивании в 200 мл дист. воды. Затем добавляют 40 мл 10%-ного раствора едкого натра, при этом происходит растворение N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты. После растворения кислоты к реакционной смеси добавляют 23,6 г (110 ммоль) хлоргидрата метилового эфира D, L-фенилаланина и доводят значение pH смеси до 6,0-6,2 добавлением 10%-ного раствора едкого натра. Затем медленно высыпают 1,29 г препарата фермента металлопротеиназы B. megaterium.

Далее синтез и выделение целевого продукта ведут аналогично примеру 1. Выход метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина составляет 92% в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту.

Пример 4. Получение метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина путем конденсации индивидуальных препаратов N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновой кислоты и хлоргидрата метилового эфира D, L-фенилаланина в присутствии термолизина.

Синтез ведут как в примере 3, но к реакционной смеси, содержащей хлоргидрат метилового эфира D, L-фенилаланина и N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту при pH 6,0 6,2, медленно добавляют 200 мг препарата термолизина с удельной активностью 13 ед. акт. DMC ("Serva", Германия).

Далее синтез и выделение метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина ведут как в примере 3. Выход конечного продукта составляет 80% в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту.

Таким образом, из примеров следует, что заявляемый способ упрощает и удешевляет процедуру получения целевого продукта путем исключения одной стадии синтеза, что дает ему существенные преимущества при использовании в производственных условиях.

Выход метилового эфира N-бензилоксикарбонил-L-аспартил-L-фенилаланина не уступает таковому в способе-прототипе и составляет в случае использования металлопротеиназы термолизина 80% (в расчете на N-бензилоксикарбонил-L-аспарагиновую кислоту).

Наиболее высокий выход (92%) заявляемый способ позволяет получать при использовании в качестве фермента металлопротеиназы B. megaterium.