иммунометрический способ определения хорионического гонадотропина человека

Формула изобретения

Иммунометрический способ определения хорионического гонадотропина человека, включающий контактирование исследуемой пробы с двумя видами антител, один из которых связывается с С-концевой частью - субъединицы хорионического гонадотропина человека, а другой вид антител с участками, расположенными вне этой области молекулы хорионического гонадотропина человека, отличающийся тем, что в качестве антител к С-концевой части - субъединицы хорионического гонадотропина человека используются иммуноглобулины, выделенные из антисыворотки к хорионическому гонадотропину человека путем связывания с пептидом, представляющим собой С-концевой фрагмент - субъединицы хорионического гонадотропина человека длиной от 13 до 24 аминокислотных остатков общей формулы: R-Arg-Leu-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln, где Р принимает значения: Cys;Ser;Pro-Ser;Ser-Pro-Ser;Pro-Ser-Pro-Ser; Leu-Pro-Ser-Pro-Ser; Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser; Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro- Ser;Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser; Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser; Alo-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser; Lys-Alo-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu -Pro-Ser-Pro-Ser, а в качестве антител к участкам, расположенным вне этой области молекулы хорионического гонадотропина человека иммуноглобулины из этой же антисыворотки, не связавшиеся с этим пептидом.

Описание изобретения к патенту

Предполагаемое изобретение относится к иммунологии, а именно к иммунометрическим способам определения хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) в биологических жидкостях организма, используемым для диагностики ранней беременности, диагностики патологии беременности, определения задержки трофобластической ткани после аборта или родов, для контроля эффективности лечения гормонпродуцирующих опухолей различного происхождения и их диагностики.

Иммунометрическое определение ХГЧ осложняется тем, что он имеет значительный иммунологический перекрест с лютеинизирующим (ЛГ), фолликулостимулирующим (ФСГ) и другими гормонами из семейства гонадотропных гормонов. Все гормоны этого семейства являются белками, состоящими из двух субъединиц и . a-Субъединица идентична у всех гормонов семейства, а b-субъединицы имеют высокий уровень гомологии (до 80% у ХГЧ и ЛГ). Единственным уникальным элементом структуры ХГЧ является С-концевая часть b-субъединицы длиной около 30 аминокислотных остатков (от 116 до 145 остатка), которая не имеет гомологии ни с одним гормоном семейства. Поэтому в современных способах определения ХГЧ используют антитела, специфичные к этой уникальной части b-субъединицы.

Известен конкурентный иммуноферментный способ определения ХГЧ в биологических жидкостях человека. В этом способе используют иммобилизованные на подложке поликлональные антитела, специфичные к Сконцевой части b--субъединицы ХГЧ. Источником антител является антисыворотка к ХГЧ или к синтетическому пептиду из аминокислотной последовательности 122-145 -субъединицы ХГЧ. Необходимую фракцию антител выделяют из антисыворотки иммунохроматографией на сорбенте с иммобилизованным С-концевым фрагментом b-субъединицы ХГЧ длиной от 10 до 30 (предпочтительно 23) аминокислотных остатков. В качестве меченного лиганда используют растворимый конъюгат данного С-концевого фрагмента с b--галактозидазой или щелочной фосфатазой [1]

Указанный способ обеспечивает высокую избирательность по отношению к ХГЧ, однако для него характерны большая продолжительность проведения анализа, составляющая 60-80 часов, и весьма ограниченное количество анализируемых проб, поскольку одной из стадий процесса является центрифугирование. Кроме того, конкурентный метод анализа требует большого расхода синтетического пептида, что существенно удорожает анализ.

Известен многосайтовый иммунометрический способ определения ХГЧ, характерным признаком которого является использование совместно иммобилизованных на подложке по крайней мере двух моноклональных антител, специфичных к различным участкам молекулы ХГЧ. Одно из антител направлено на эпитоп, локализованный в пределах 1-109 аминокислотных остатков -субъединицы ХГЧ, другое антитело взаимодействует с С-концевой областью 109-145 b--субъединицы. Для иммуноферментной детекции гормона применяют растворимый конъюгат одного из этих моноклональных антител с различными ферментами [2]

Недостатками известного способа являются сложность и трудоемкость получения устойчивых и продуктивных гибридных клонов, вырабатывающих моноклональные антитела к необходимым антигенным детерминантам ХГЧ, низкая стабильность моноклональные антител в процессе хранения или при изменении рН и температуры. При иммобилизации на подложку одновременно двух типов антител, кроме того, наблюдается неудовлетворительная воспроизводимость ее антигенсвязывающих свойств.

Наиболее близким к предлагаемому является иммунометрический способ определения ХГЧ, включающий использование выделенных из поликлональной сыворотки или моноклональных антител к пептидному фрагменту 115-145, полученному из --цепи ХГЧ обработкой трипсином. В качестве вторых антител используют моноклональные антитела к антигенным детерминантам ХГЧ, достаточно удаленным от указанной области молекулы, чтобы эта пара антител могла одновременно связываться с определяемым ХГЧ. Одно из антител иммобилизуют на твердой фазе, а второе, радиоактивно меченное или коньюгированное с ферментом, например, с пероксидазой хрена, используют для детекции ХГЧ [3]

Метод характеризуется отсутствием перекрестных иммунологических реакций с близкородственным лютеинизирующим гормоном и позволяет определять количество ХГЧ в образцах мочи человека. К недостаткам известного способа можно отнести сложность получения пептидного фрагмента ХГЧ, используемого для иммунизации животных и выделения специфических антител, а главное необходимость использования двух различных источников антител (моноклональные антитела или антисыворотка к пептидному фрагменту 115-145 и антитела к удаленным антигенным детерминантам ХГЧ). Кроме того, известно, что антитела, полученные путем иммунизации животных короткими фрагментами белка (антипептидные антитела), как правило, имеют более низкий аффинитет по отношению к нативному белку в сравнении с антителами, полученными иммунизацией целым нативным белком [4] Поэтому методы иммуноанализа, основанные на использовании антипептидных антител, отличаются невысокой чувствительностью.

Предметом предполагаемого изобретения является способ иммунометрического определения ХГЧ, основанный на использовании двух антител различной специфичности. Согласно предлагаемому способу, высокоспецифические антитела к С-концевому участку -субъединицы ХГЧ и антитела к антигенным детерминантам, расположенным вне этой области молекулы, получают последовательно из одного источника антисыворотки к ХГЧ.

Антисыворотки к ХГЧ получают известными способами путем иммунизации животных очищенными препаратами ХГЧ с использованием адъювантов. Для выделения из антисывороток антител различной специфичности применяют иммуносорбент, состоящий из пептида, имеющего аминокислотную последовательность С-концевого фрагмента b-субъединицы ХГЧ длиной от 13 до 24 аминокислотных остатков, ковалентно закрепленного на нерастворимой матрице. Структура пептида приведена ниже:

R-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln,

где R Cys

Ser

Pro-Ser

Ser-Pro-Ser-

Pro-Ser-Pro-Ser

Leu-Pro-Ser-Pro-Ser

Ser-lau-Pro-Ser-Pro-Ser

Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser

Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser

Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser

Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu.-Pro-Ser-Pro-Ser

Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser

Пептид может быть получен путем расщепления очищенного ХГЧ протеолитическими ферментами либо синтетическим путем, используя методы и приемы синтеза пептидов в растворе или на твердой фазе, описанные в литературе.

В качестве нерастворимой матрицы для иммуносорбента можно использовать модифицированные кремнеземы, целлюлозы, гидрофильные синтетические полимеры, сшитые декстраны и агарозы и другие известные материалы, применяющиеся для этих целей. Для ковалентного закрепления пептида в матрицу известными способами вводятся активные группы, способные реагировать со свободными тиольными или аминогруппами в составе пептида, например имидоэфирные, эпоксидные, альдегидные, винилсульфоновые, активированные сложноэфирные, несимметричные дисульфиды.

Для выделения первых антител проводят иммуносорбцию антисыворотки на сорбенте с иммобилизованным пептидом. После промывания иммуносорбента специфически связавшиеся антитела элюируют с иммуносорбента с помощью хаотропных элюентов или буферных солевых растворов с низкими значениями рН и использует в качестве первых антител.

Вторые антитела выделяет из фракции сыворотки, не связавшейся с иммуносорбентом. Для очистки этих антител использует ионообменную хроматографию или иммуносорбцию на сорбенте с иммобилизованным ХГЧ.

Первые антитела, полученные указанным способом, имеют узкоспецифичную направленность на антигенные детерминанты, локализованные в пределах уникального С-концевого участка b-субъединицы ХГЧ 115-145, и не способны связываться ни с одним гормоном семейства гонадотропинов, кроме ХГЧ. Вторые антитела обладают широкой специфичностью и взаимодействуют со всеми остальными антигенными детерминантами a-- и -субъединиц ХГЧ.

Антитела первого и второго типов, полученные таким образом, способны одновременно реагировать с одной молекулой ХГЧ без интерференции и, следовательно, могут быть использованы для прямого иммунометрического определения гормона. Узкая специфичность антител первого типа исключает возможность нежелательной одновременной детекции ЛГ, ФСГ и других родственных гормонов.

Прямое иммунометрическое определение ХГЧ с помощью двух антител разной специфичности заключается в связывании антител первого и второго типов с одной молекулой определяемого гормона и избирательной детекции образовавшегося иммунного комплекса.

С этой целью в антитела одного типа (первого или второго) вводится метка, позволяющая обнаружить их в свободном виде или в составе иммунного комплекса известными методами. В качестве такой метки может использоваться радиоактивная, флуоресцентная, ферментная (например, метка пероксидазой хрена, щелочной фосфатазой, b-галактозидазой и другими ферментами), биотиновая и иные известные метки.

Антитела другого типа закрепляются на нерастворимой подложке или ином носителе, позволяющем избирательно выделить их из раствора. Такими подложками или носителями могут служить пластиковые иммунологические планшеты, сшитые декстраны, агарозы, синтетические гидрофильные полимеры, целлюлоза, бумага, растворимые осаждаемые полимеры и другие известные материалы, применяющиеся для этих целей.

В таком случае при взаимодействии определяемого ХГЧ с антителами обоих типов из раствора могут быть выделены и детектированы только иммунные комплексы, одновременно содержащие антитела и первого, и второго типов. При этом величина детектируемого сигнала прямо пропорциональна концентрации ХГЧ в анализируемой пробе. Поскольку другие гормоны семейства гонадотропинов не способны связываться с антителами первого типа, наличие или отсутствие этих гормонов в пробе не влияет на результаты определения ХГЧ.

На практике использование в качестве нерастворимой подложки стандартных пластиковых иммунологических планшетов и применение в качестве метки радиоактивного иода или пероксидазы хрена позволяет измерять концентрацию ХГЧ в сыворотке крови или моче с нижним пределом обнаружения до 50 МЕ/л. Более тщательный подбор условий анализа позволяет снизить указанный предел до 10-15 МЕ/л, однако для целей широкого применения способа это нецелесообразно. В медицинской практике определение уровня ХГЧ в крови и особенно в моче используется для диагностики ранней беременности и ряда патологий, для которых характерно повышение уровня гормона в десятки и сотни раз относительно нормального уровня, составляющего 20-30 МЕ/л. Предлагаемый способ иммунометрического определения ХГЧ, основанный на получении и использовании двух поликлональных антител разной специфичности из одного источника - антисыворотки к ХГЧ, является новым и неизвестным из научной и патентной литературы.

Он позволяет использовать в качестве исходного сырья антисыворотку к ХГЧ, которую легко получить известными приемами путем иммунизации животных доступными препаратами очищенного ХГЧ. Эта антисыворотка к цельной молекуле ХГЧ, в отличие от сывороток к отдельным фрагментам молекулы ХГЧ, в том числе синтетическим, содержит высокоаффинные антитела ко всем доступным в биологически активной молекуле линейным и конформационным детерминантам. Предлагаемый способ позволяет полностью использовать эти ее положительные свойства.

На фиг. 1 изображен калибровочный график для количественного определения ХГЧ методом РИА (пример 23); на фиг. 2 калибровочный график для количественного определения ХГЧ методом ИФА (пример 25); на фиг. 3 калибровочный график для количественного определения ХГЧ методом ИФА (пример 24); на фиг. 4 калибровочный график для количественного определения ХГЧ методом ИФА (пример 26); на фиг. 5 калибровочный график для количественного определения ХГЧ методом ИФА (пример 27); на фиг. 6 калибровочный график для количественного определения ХГЧ методом ИФА (пример 28).

Сущность предполагаемого изобретения иллюстрируется примерами. При описании примеров используются следующие сокращения и условные обозначения:

ХГЧ хорионический гонадотропин человека

ЛГ лютеинизирующий гормон

ФСГ фолликулостимулирующий гормон

ИФА иммуноферментный анализ

РИА радиоиммуноанализ

БСА бычий сывороточный альбумин

ME международная единица

ДМФА диметилформамид

Fmoc 9-флуоренилоксикарбонил

ТФУ трифторуксусная кислота

Обозначения используемых буферные растворов:

ЗФР забуференный физиологический раствор (0,15 М NaСl, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2)

ЗФР-Т забуференный физиологический раствор с твином-20 (0,15 М NaCI, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2, 0.05% твин-20)

Буфер А 0,5 М NaCI, 0,1 М фосфат натрия, рН 7,2

Буфер Б 0,5 М NaCI, 0,2 М СН₃СООН

Буфер В 0,5 М глицин-HCl, рН 2,3

Буфер Г 0,1 М нитрат натрия, рН 5,5, 0,3% H₂О₂

Пример 1. Синтез пептида Cуs-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp- Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln (ПIЗ).

3 г бисерного сополимера 99% стирола и 1% дивинилбензола (Fluka, Швейцария) аминометилировали по методу Митчелла [ 5 Полученный аминометил-сополимер с содержанием аминогрупп 0,90 ммол/г превращали в 4-оксиметилфеноксиацетамидометилсополимер по методу, описанному в работе [6]

300 мг синтезированного оксиметил-содержащего сополимера, 0,6 ммол Fmoc-L-глутамина, 0,6 ммол дициклогексилкарбодиимида и 0,1 ммол 4-диметиламинопиридина в смеси 3 мл 1,2-дихлорэтана и 1 мл ДМФА перемешивали 3 ч при комнатной температуре. Сополимер отфильтровывали, промывали на фильтре 5 х 10 мл ДМФА и 5 х 10 мл хлороформа и высушивали в вакууме. По данным аминокислотного анализа, степень аминоацилирования сополимера составила 0,65 ммол/г.

Полученный Fmoc-L-глутаминил-сополимер загрузили в реактор для твердофазного синтеза пептидов и проводили наращивание пептидной цепи по следующему циклу:

1. 10 мл ДМФА (2 х 2 мин).

2. 10 мл 33% пиперидина в ДМФА (1 х 2 мин, 1 х 5 мин)

3. 10 мл ДМФА (6 х 1 мин)

4. 1,0 ммол очередной Fmоc-L-аминокислоты, 1,0 ммол трис(диметиламино)xлорфосфония перхлората, 2,0 ммол 1-гидроксибензотриазола и 2,2 ммол N-метилморфолина в 4 мл ДМФА (1 х 90 мин).

5. 10 мл ДМФА (2 х 2 мин)

Циклы наращивания пептидной цепи повторяют до тех пор, пока не будет синтезирован пептид необходимой последовательности, в пептидную цепь последовательно вводились следующие аминокислоты: Fmоc-L-пролин, Fmoc-L-лейцин, Fmоc-L-изолейцин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-(0-трет-бутил)-L-треонин, Fmoc-(b-трет-бутил)-L-аспарагиновая кислота, Fmoc-(0-трет-бутил)-L-серин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-L-глицин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-L-лейцин, Fmoc-[N^G-(4-метокси-2,3,5-триметилбензолсульфонил)]-L-аргинин.

На этой стадии полученный пептидил-сополимер выгружали из реактора, промывали хлороформом (3 х 10 мл) и высушивали в вакууме, половину пептидил-сополимера сохраняли для использования в синтезе пептида П24 (пример 2), а вторую половину вновь загрузили в реактор и провели цикл наращивания пептидной цепи с использованием Fmоc-(S-тритил)-L-цистеина, затем операции 1-3 для отщепления Fmоc-группы.

Пептидил-сополимер выгружали из реактора, промывали хлороформом (3 х 10 мл) и высушивали в вакууме. Для отщепления и деблокирования пептида пептидил-сополимер инкубировали 1 ч при комнатной температуре в смеси 5 мл ТФУ, 0,1 мл м-крезола, 0,5 мл тиоанизола и 0,5 мл метансульфокислоты. Сополимер отфильтровывали, промывали на фильтре 3 х 2 мл ТФУ. Фильтрат выливали в 250 мл охлажденного эфира, выпавший осадок пептида отфильтровывали, тщательно промывали эфиром и сушили в вакууме, выход 120 мг.

Пептид растворили в 2 мл воды, содержащей 6% СН₃СООН и 3% 2-меркаптоэтанола и очищали препаративной обращенно-фазовой хроматографией на колонке 9,5 х 250 мм с Lichrosorb RP-l8 5 mcm (Merck, ФРГ) в градиенте от 0 до 90% CH₃CN, содержащем 0,1% ТФУ. (длительность градиента 1OO мин, скорость потока 4 мл/мин, длина волны УФ-детектора 226 им). Фракции, содержащие целевой пептид, объединяли и лиофилизовали. Выход 45 мг (30%), хроматографическая чистота по ВЭЖХ 96% Аминокислотный состав после гидролиза 6 н. HCl (110^oС, 24 ч) в вакуумированной запаянной ампуле:

Asp 0,93 (1); Ser 0,88 (1); Thr 0,92 (1); Glu 1,05 (1);

Pro 3,55 (4); Gly 0,96 (1); Ile 0,85 (1); Leu 2,00 (2);

Arg 1,00 (1); Cys нe определяется.

Пример 2. Синтез пептида Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-Leu-Pro- Ser-Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Asp-Thr-Pro-Ile-Leu- Pro-Gln (П24)

Синтез проводили, исходя из части пептидил-сополимера, полученного и зарезервированного при синтезе пептида П13 (пример 1). Для наращивания пептидной цепи использовали последовательно следующие аминокислоты: Fmoc-(0-трет-бутил)-L-серин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-(0-трет-бутил)-L-серин, Fmoc-L-пролин, Fmoc- L-лейцин, Fmoc-(0-трет-бутил)-L-серин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-L-пролин, Fmoc-L-аланин, Fmoc-(N^e-трет-бутилоксикарбонил)-L-лизин.

Синтетические циклы, отщепление и деблокирование пептида и eго очистку осуществляли, как описано в примере 1. Получено 55 мг пептида П24 (23%), хроматографическая чистота по ВЭЖХ 95% Аминокислотный состав после гидролиза 6 н. НС1 (11O^oС, 24 ч) в вакуумированной запаянной ампуле:

Asp 0,94 (1); Sеr 3,58 (4); Thr 0,90 (1); Glu 1,02 (1);

Pro 8,23 (9); Gly 0,99 (1); Ala 1,00 (1); Ile 0,85 (1);

Leu 3,11 (3); Lys 1,06 (1); Arg 1,00 (1).

Пример 3. Получение пептида П13, иммобилизованного на тиол-сефарозе (I).

4 мл активированной тиол-Сефарозы (Pharmacia LKB Bioteahnology, Швеция), содержащей 2,3 мкмоль/мл активных 2-пиридилдитио-групп, промывали на фильтре 4 х 10 мл 1 М раствора NaСl, содержащего 0,1 М СH₃СООNa, рН 4,5. К суспензии сорбента общим объемом 4,5 мл добавили раствор 8 мг пептида П13 в 0,1 мл воды и перемешивали 18 ч при комнатной температуре. Количество иммобилизованного пептида, измеренное по накопление в растворе 2-тиопиридона, составило 0,4 мкмоль пептида на 1 мл сефарозы. Полученный иммуносорбент I промывали на фильтре 5 х 10 мл буфера А и хранили до использования при +4^oC.

Пример 4. Получение пептида П24, иммобилизованного на BrCN-Сефарозе (II).

Иммобилизацию пептида на BrCN-Сефарозе (Pharmacia LKB Biote- chnology, Швеция) проводили по методике, рекомендованной фирмой производителем, к суспензии 2 мл BrCN-Cефарозы в 0,1% NaHCO₃, рН 9,0, содержащем 0,5 М NaCl, общим объемом 3 мл добавляли 20 мг пептида П24 (пример 2) и перемешивали 18 ч при 4^oС. Непрореагировавшие активированные группы блокировали 0,1 М этаноламином, рН 8,0, 2 часа при 20-25^oС, затем иммуносорбент промывали на фильтре 5 х 5 мл буфера А и хранили до использования при +4^oС. Количество иммобилизованного пептида определяли по разнице между содержанием его в исходном растворе и фильтрате после инкубации с BrСN-сефарозой, для чего аликвоты исходного раствора и фильтрата подвергали гидролизу 6 N НС1 (120^oC, 24 часа) и количественному аминокислотному анализу. Полученный иммуносорбент 11 содержал 5 мг пептида П24 на 1 мл сефарозы.

Пример 5. Получение пептида П24, иммобилизованного на кремнеземном сорбенте (Ill).

К 5 г силохрома С-80, содержащего пропиламидосукцинатные группы, полученного по методу [7] в 25 мл сухого этилацетата добавляли 460 мг (4 ммол) N-гидроксисукцинимида и 960 мг (5 ммол) гидрохлорида N"-этил-N"-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида и перемешивали 16-18 ч при 20-25^oС. Носитель промывали этилацетатом, пропанолом-3, ацетоном и высушивали в вакууме. Для иммобилизации 10 мг пептида П24 растворяли в буфере А и добавляли к 1 г активированного кремнеземного сорбента. Суспензию перемешивали 3 ч при 20-25^oС, носитель отфильтровывали и промывали буфером А. Непрореагировавшие активированные группы блокировали 2 часа 1 М этаноламином рН 8,0. После отмывки иммуносорбента буфером А его использовали для заполнения колонок. Количество иммобилизованного пептида, определенное, как в примере 4, составило 7 мг на 1 г полученного иммуносорбента III.

Пример 6. Получение ХГЧ, иммобилизованного на BrCN-сефарозе (IV).

20 мг очищенного ХГЧ (НПК "Гормон", Москва) иммобилизовали на 2 мл BrСN-сефарозы, как описано в примере 4. Количество иммобилизованного ХГЧ определяли по его содержанию в растворе до и после иммобилизации, измеряя концентрацию белка по методу Лоури.1 мл иммуносорбента IV содержал 5 мг ХГЧ.

Пример 7. Получение ХГЧ, иммобилизованного на кремнеземном сорбенте (V).

20 мг очищенного ХГЧ (НПК "Гормон", Москва) иммобилизовали на 2 г активированного кремнеземного сорбента, как описано в примере 5. Количество иммобилизованного ХГЧ определяли по его содержании в растворе до и после иммобилизации, измеряя концентрацию белка по методу Лоури. 1 г полученного иммуносорбента IV содержал 8 мг ХГЧ.

Пример 8. Получение кроличьей антисыворотки к ХГЧ (VI).

Антисыворотку к ХГЧ получали путем иммунизации трех кроликов очищенным препаратом ХГЧ (Московский эндокринный завод). Каждому кролику вводили содержимое одной ампулы (1000 МЕ), эмульгированное в 0,5 мл ЗФР и 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда. Иммунизацию повторяли с интервалами в 2 недели в течение двух месяцев, затем ежемесячно. Забор крови проводили первый раз через два месяца после начала иммунизации, затем через 10 дней после очередного введения антигена.

Титры антисывороток определяли методами РИА и ИФА. Для РИА использовали 96-луночные круглодонные планшеты для микротитрования (Ленинградский завод медицинских полимеров, ТУ 64-2-278-79), для ИФА 96-луночные плоскодонные планшеты (ПО Красноярский химкомбинат "Енисей", ТУ 64-2-375-80). В лунки планшетов вносили по 50 мкл раствора ХГЧ 5 МЕ/мл в ЗФР, в контрольные лунки вносили по 50 мкл ЗФР.

Планшеты инкубировали 16-18 ч при 4^oC, затем содержимое лунок удаляли и промывали лунки 5 раз ЗФР-T.В лунки вносили по 200 мкл 1% р-ра БCА, выдерживали 1 ч при 37^oС, раствор удаляли, лунки промывали 5 раз буфером ЗФР-Т. Подготовленные десятикратные разведения исходных антисывороток на буфере ЗФР-Т по 100 мкл вносили в лунки планшетов (по две лунки на разведение) и инкубировали 30 мин при 37^oС.

Содержимое лунок удаляли, планшеты промывали 5 раз буфером ЗФР-Т и в лунки добавляли по 100 мкл детектирующие антител. Для РИА использовали ¹²⁵I-меченные козьи антитела против иммуноглобулинов кролика в ЗФР-Т с 0,4% БСA (удельная активность 5*10⁵расп/мин). Для ИФА использовали конъюгат козьих антител против иммуноглобулинов кролика с пероксидазой хрена в ЗФР-Т с О,4% БCА в разведении 1:2000. Инкубацию проводили 30 мин при 37^oC. Cодержимое лунок удаляли, промывали 5 раз буфером ЭФР-Т. Для РИА планшеты разрезали на отдельные лунки и количество связавшихся меченых антител подсчитывали на гамма-счетчике (Mini-Gamma, LKB). Для ИФА в лунки вносили по 100 мкл раствора ортофенилендиамина в буфере Г. Через 30 мин реакцию останавливали добавлением в лунки по 50 мкл 2 М серной кислоты и измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм на фотометре Multiscan.

За титр антисыворотки принимали ее максимальное разведение, при котором измеряемый сигнал в лунках, содержащих антиген, в 2,1 раза превышал сигнал в контрольных лунках.

Сыворотки, имеющие титры не хуже 1: 10000 и в РИА, и в ИФА, объединяли для дальнейшего использования (антисыворотка VI).

Пример 9. Получение антител первого типа из кроличьей антисыворотки VI на иммуносорбенте 1 (антитела первого типа VII).

Иммуносорбент 1 (пример 3) промывали три раза попеременно буфером А и буфером Б и уравновешивали буфером А. К 9 мл антисыворотки VI (пример 6) добавляли 3 мл 2 М р-ра NaСI и смешивали с 2 мл иммуносорбента 1. Суспензию инкубировали 16-18 ч при 4^oС и переносили в хроматографическую колонку. Колонку промывали 5 объемами буфера А, затем элюировали связавшиеся антитела буфером Б или В. Полученные антитела первого типа VII проверяли на специфичность титрованием в РИА и ИФА, как описано в примере 8, используя вместо разведений сывороток двукратные разведения полученных антител. Титр антител в ИФА 1:2000.

Пример 10. Получение козьей антисыворотки к ХГЧ (VIII).

Антисыворотки получали, как в примере 8, используя для иммунизации козлов. Титры антисывороток определяли в ИФА, как описано в примере 8, используя в качестве антигена ХГЧ или пептид П24. В последнем случае в лунки вносили по 50 мкл раствора пептида (0,1 мг/мл) в 0,1 М NaНСО₃. Титры объединенной антисыворотки VIII составляли 1:1000000 и 1:100000 соответственно.

Пример 11. Получение антител первого типа из козьей антисыворотки VIII на иммуносорбенте 1 (антитела первого типа IX).

Иммуносорбент 1 (пример 3) отмывали, как в примере 9, переносили в колонку, промывали колонку буфером А и наносили на нее козью антисыворотку VIII, разбавленную, как описано в примере 9, из расчета 4 мл сыворотки на 1 мл сорбента. Элюцию специфических антител с колонки и тестирование антител левого типа IX проводили, как в примере 9. Титр полученные антител в ИФА 1:20000.

Пример 12. Получение антител первого типа из козьей антисыворотки VIII на иммуносорбенте II или III (антитела первого типа X).

Получение антител проводили, как в примере 11, используя иммуносорбент II или III с иммобилизованным пептидом П24 (пример 4 или 5). Полученные антитела первого типа X тестировали титрованием в ИФА, как описано в примере 9. Титр полученных антител в ИФА 1:25000.

Пример 13. Выделение антител второго типа XI из кроличьей антисыворотки VI ионообменной хроматографией.

Фракцию кроличьей антисыворотки VI, не связавшуюся с иммуносорбентом I в процессе получения антител первого типа VII (пример 9), диализовали против ЗФР, разводили в 4 раза бидистиллированной водой и наносили на колонку с анионообменником Полисил СА 16 х l00 мм (Вектор-БиоПродукт, Кольцoво, Новосибирская обл.), уравновешенную десятикратно разбавленным ЗФР. Элюцию антител проводили 0,01 М КН₂РО₄, рН 7,5. Полученные антитела второго типа XI тестировали титрованием в ИФА, как описано в примере 9. Титр антител 1:5000.

Пример 14. Выделение антител второго типа XII из козьей антисыворотки VIII ионообменной хроматографией. Проводили, как в примере 13, используя фракцию козьей антисыворотки VIII, не связавшуюся с иммуносорбентом в процессе получений антител первого типа IX (пример 11), полученные антитела второго типа XII тестировали титрованием в ИФА, как описано в примере 9. Титр антител 1:200000.

Пример 15. Выделение антител второго типа XIII из козьей антисыворотки VIII ионообменной хроматографией.

Проводили, как в примере 13, используя фракцию козьей антисыворотки VIII, не связавшуюся с иммуносорбентом в процессе получения антител первого типа X (пример 12). Полученные антитела второго типа XIII тестировали титрованием в ИФА, как описано в примере 9. Титр антител 1:300000.

Пример 16. Выделение антител второго типа XIV из кроличьей антисыворотки VI аффинной хроматографией.

Фракцию кроличьей антисыворотки IV, не связавшуюся с иммуносорбентом I в процессе получения антител первого типа VII (пример 9), наносили на колонку с иммуносорбентом IV или V (пример 6 или 7). Колонку промывали буфером А и элюировали связавшиеся антитела, как описано в примере 9. Полученные антитела второго типа XIV тестировали титрованием в ИФА, как в примере 10, используя в качестве антигенов ХГЧ и пептид П24. Антитела связывались с ХГЧ и не реагировали с пептидом, титры в ИФА 1:5000 и >1:10 соответственно.

Пример 17. Выделение антител второго типа XV из козьей антисыворотки VIII аффинной хроматографией.

Проводили, как в примере 16, используя фракцию козьей антисыворотки VIII, не связавшуюся с иммуносорбентом в процессе получения антител первого типа X (пример 12). Полученные антитела второго типа XV тестировали титрованием в ИФА, как описано в примере 10, используя в качестве антигенов ХГЧ и пептид П24. Антитела связывались с ХГЧ и не реагировали с пептидом, титры в ИФА 1:250000 и <1:100 соответственно.

Пример 18. Синтез конъюгата кроличьих антител второго типа XI с пероксидазой хрена (XVI).

Конъюгацию проводили по методу [8]

5 мг пероксидазы хрена с Rz > 3,0 растворяли в 1 мл 0,1 М NaНСО₃, содержащего 5 мМ NаIO₄, и инкубировали 2 ч при 22^oС. К смеси добавляли 15 мг lgG (кроличьи антитела второго типа XI, пример 13) в 2 мл NaHCO₃, рН 9,2 и 0,5 г cефадекса G-25, перемешивали и выдерживали 3 ч при 22^oС. Суспензию фильтровали на стеклянном фильтре, фильтрат охлаждали до +4^oC и добавляли к нему 1/20 объема раствора NаBH₄ (5 мг/мл) в 0,1 мM NaOH, выдерживали 30 мин, затем добавляли еще 1/10 объема раствора NаBH₄ и выдерживали еще I ч.

К смеси добавляли равный объем насыщенного сульфата аммония и оставляли на ночь. Выпавший осадок конъюгата XVI растворяли в 1 мл ЗФР, содержащем 1% БСА, и добавляли равный объем глицерина для стабилизации. Тестирование конъюгата проводили титрованием в ИФА, как описано в примере 8, но вместо разведений сыворотки и конъюгата антивидовых антител использовали двукратные разведения полученного конъюгата. Титр конъюгата XVI составил 1:10000.

Пример 19. Синтез конъюгата кроличьих антител второго типа XIV с пероксидазой хрена (XVII).

Синтез проводили, как в примере 18, используя для получения конъюгата кроличьи аффинноочищенные антитела второго типа XIV (пример 16). Титр полученного конъюгата в ИФА составил 1:50000.

Пример 20. Синтез конъюгата козьих антител второго типа XII с пероксидазой хрена (XVIII).

Синтез проводили, как в примере 18, используя для получения конъюгата козьи антитела второго типа XII (пример 14). Титр полученного конъюгата в ИФА составил 1:25000.

Пример 21. Синтез конъюгата козьих антител второго типа XIII с пероксидазой хрена (ХIХ).

Синтез проводили, как в примере 18, используя для получения конъюгата козьи антитела второго типа XIII (пример 15). Титр полученного конъюгата в ИФА составил 1:100000.

Пример 22. Синтез конъюгата козьих антител первого типа Х с пероксидазой хрена (ХХ).

Синтез проводили, как в примере 18, используя для получения конъюгата козьи антитела первого типа X (пример 12). Титр полученного конъюгата в ИФА составил 1:10000.

Пример 23. Количественный радиоиммунологический анализ ХГЧ. Определение хорионического гонадотропина в моче человека проводили в иммунометрическом "сэндвич"- варианте РИА.

Для РИА использовали 96-луночные круглодонные планшеты для микротитрования (Ленинградский завод медицинских полимеров, ТУ 64- 278-79). В каждую лунку планшетов вносили по 50 мкл антител второго типа XI (пример 13) в буфере Б в концентрации 0,1 мг/мл и выдерживали 16-18 ч при 4^oС. Содержимое лунок удаляли, лунки промывали 5 раз раствором ЗФР-Т В лунки вносили по 200 мкл 1% БСА, выдерживали 1 час при 37^oС, затем вносили по 100 мкл исследуемых образцов мочи (исходных или разведенных ЗФР-Т). Пробы инкубировали 30 мин при 37^oС или 60 мин при 22^oС.

После удаления из лунок содержимого и 5-кратной промывки раствором ЗФР-Т в каждую лунку добавляли по 5*10₅ расп/мин ¹²⁵I-меченых антител первого типа VII (пример 9) в 100 мкл ЗФР-Т с 0,4% БСА (введение радиоактивной метки в антитела осуществляли по методике [9]). Инкубацию проводили в течение 30 мин при 37^oC или 60 мин при 22^oС. После удаления из лунок меченых антител и пятикратной промывки раствором ЗФР-Т планшеты разрезали на отдельные лунки, и количество связавшихся меченых антител определяли на гамма-счетчике (Mini-Gamma, LKB).

Для контроля конъюгата в лунки вместо образцов мочи добавляли ЗФР-Т. В качество отрицательного контроля использовали контрольный образец мочи, не содержащий ХГЧ, а в качестве положительного контроля образец мочи с определенным ранее содержанием ХГЧ. Для определения чувствительности метода использовали рабочий стандартный образец ХГЧ, полученный из ГНИИСКЛС МЗ СССР. Для построения калибровочного графика при количественном определении ХГЧ использовали рабочий стандартный образец ХГЧ (или положительный образец мочи, предварительно откалиброванный по этому стандарту). Калибровочный график для определения ХГЧ методом РИА представлен на фиг. 1. Чувствительность данного метода 200 МЕ/л.

Для определения специфичности метода определения ХГЧ исследовали иммунологический перекрест с близкородственными лютеинизирующим гормоном (ЛГ) и фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) человека. Образцы очищенных ЛГ и ФСГ были получены в лаборатории биохимии белковых гормонов Института экспериментальной эндокринологии ВЭНЦ АМН СССР. Образцы ЛГ и ФСГ вносили в лунки планшетов вместо образцов мочи в концентрации 1000 МЕ/л, что многократно превышает их максимальное содержание в моче (физиологический пик во время овуляции составляет для ЛГ 70 МЕ/л, для ФСГ 15 МЕ/л). Иммунологический перекрест при этом выявлен не был, величина сигнала достоверно не отличалась от фонового значения. Специфичность метода 100%

Пример 24. Иммуноферментный анализ ХГЧ с использованием антител первого типа VII и конъюгата XVI.

ИФА проводили аналогично РИА (пример 23), используя в качестве твердой подложки 96-луночные плоскодонные планшеты (ПО Красноярский химкомбинат "Енисей", ТУ 64-2-375-86). В лунки планшетов вносили по 50 мкл антител первого типа VII (пример 9) в концентрации 0,03 мг/мл. В качестве детектирующих антител вместо ¹²⁵I-меченых антител использовали конъюгат XVI (пример 18) в разведении 1:200 в ЗФР-Т с 2% нормальной кроличьей сыворотки. Реакцию пероксидазы с субстратом проводили, как в примере 8.

При качественном определении ХГЧ учет реакции вели визуально по желтой окраске содержимого лунок, для сравнения использовались лунки с положительным и отрицательным контролями.

При количественном определении ХГЧ оптическую плотность в лунках на фотометре "Multiscan" при длине волны 492 нм. Калибровочный график для определения ХГЧ строили по рабочему стандартному образцу ХГЧ, полученному из ГНИИСКЛС MЗ СССР (фиг 3). Для характеристики чувствительности метода определяли минимальную концентрацию ХГЧ, при которой значение оптической плотности превышает в 2,1 раза значение оптическую плотность в отрицательном контроле. Для данного варианта ИФА чувствительность составляла 100 МЕ/л. Специфичность метода, определенная по аналогии с примером 23, составила 100%

Пример 25. Иммуноферментный анализ ХГЧ с использованием антител первого типа VII и конъюгата XVII.

ИФА проводили, как в примере 24, используя в качестве детектирующих антител конъюгат XVII (пример 19) в разведении 1:500. Калибровочный график для определения ХГЧ представлен на фиг.2. Чувствительность метода 50 МЕ/л, специфичность 100%

Пример 26. Иммуноферментный анализ ХГЧ с использованием антител первого типа IX и конъюгата XVIII.

ИФА проводили, как в примере 24, используя в качестве связывающих антител на подложке антитела первого типа IX (пример 11), а в качестве детектирующих антител конъюгат XVIII (пример 20) в разведении 1:400. Калибровочный график для определения ХГЧ представлен на фиг. 4. Чувствительность метода 75 МЕ/л, специфичность 100%

Пример 27. Иммуноферментный анализ ХГЧ с использованием антител первого типа X и конъюгата XIX.

ИФА проводили, как в примере 24, используя в качестве связывающих антител на подложке антитела первого типа X (пример 12), а в качестве детектирующих антител конъюгат XIX (пример 21) в разведении 1:2000. Калибровочный график для определения ХГЧ представлен на фиг. 5. Чувствительность метода 50 МЕ/л, специфичность 100%

Пример 28. Иммуноферментный анализ ХГЧ с использованием антител второго типа ХV и конъюгата XX.

ИФА проводили, как в примере 24, используя в качестве связывающих антител на подложке антитела второго типа X (пример 17), а в качестве детектирующих антител конъюгат XX (пример 22) в разведении 1:200. Калибровочный график для определения ХГЧ представлен на фиг. 6. Чувствительность метода 100 МЕ/л, специфичность 100% иммунологического перекреста с ЛГ и ФСГ не выявлено.

Пример 29. Медицинские испытания: качественное определение ХГЧ у женщин с подозрением на малый срок беременности.

С помощью метода ИФА, описанного в примере 27, было проведено обследование 66 женщин с подозрением на малый срок беременности. ХГЧ был выявлен в моче у 34 женщин, у 32 не был обнаружен. Из 32 женщин с отрицательным анализом на ХГЧ только у одной впоследствии обнаружена прогрессирующая беременность. В данном случае на момент проведения анализа имела место беременность менее одной недели, повторный же анализ произведен не был. Наличие беременности у всех 34 женщин с положительным анализом на ХГЧ было подтверждено гистологическими исследованиями после производства мини-аборта (см. протокол медицинских испытаний).

Таким образом, предлагаемый способ позволяет надежно выявлять беременность у женщин при сроке не менее 7-8 дней т.е. за 6-7 дней до очередной менструации.

Пример 30. Медицинские испытания: качественное определение ХГЧ у женщин со сроком беременности от 5-6 до 34 недель.

С помощью метода ИФА, описанного в примере 24, было проведено обследование 124 женщин, пребывавших на лечении в стационаре. Из общего числа 86 женщин имели беременность на различных сроках (от 5-6 недель до 34 недель). Кроме того, у 38 гинекологических больных с явным отсутствием беременности обследование проведено с контрольной целью. В результате проведенного качественного определения ХГЧ беременность подтверждена у всех 86 женщин, положительных анализов на ХГЧ во второй группе (38 гинекологических больных) не было (см. протокол медицинских испытаний).

Таким образом, при сроках беременности 5-6 недель и более ХГЧ выявляется в моче со 100% вероятностью.

Пример 31. Медицинские испытания: количественное определение ХГЧ в моче у женщин с различными патологиями беременности.

Количественное определение ХГЧ в исследуемых образцах мочи проводили, как в примере 25, используя соответствующий калибровочный график из примера 25 (фиг.2). Исследуемые пробы разводили в 10, 20 или 40 раз для того, чтобы полученные значения оптической плотности попадали на калибровочный график. Параллельно проводили исследование цитологических мазков. Было обследовано 5 женщин, причем исследование проводили в динамике еженедельно в течение 1-6 месяцев. Было выявлено полное соответствие результатов количественного определения ХГЧ и результатов исследования цитологических мазков. Низкий уровень содержания ХГЧ в моче обследуемых женщин (менее 5000 МЕ/л) соответствовал недостаточной степени гормональной регуляции во время беременности с явными клиническими проявлениями угрозы ее прерывания (см. протокол медицинских испытаний).

Таким образом, предлагаемый способ перспективен для оценки и своевременной диагностики недостаточности плаценты, что позволяет предупредить ряд осложнений, представляющих угрозу для внутриутробного развития плода.

Пример 32. Клинические испытания: обследование больной с онкозаболеванием.

Методом ИФА, описанным в примере 35, исследовали образцы мочи больной К. 31 год, с диагнозом "пузырный занос". Инструментальная ревизия стенок полости матки с удалением ткани пузырного заноса произведена 23.01.91. Количественное определение ХГЧ проводили в динамике в течение 3 недель: 24.01.91 5000 МЕ/л ХГЧ в моче, 31.01.91 70 МЕ/л ХГЧ в моче, 07.02.91 ХГЧ не выявляется.

Эти данные соответствовали клинической картине заболевания (см. протокол медицинских испытаний).

Таким образом, предлагаемый способ может применяться и в онкологии для ранней диагностики и оценки эффективности лечения гормонпродуцирующих опухолей.

Список использованной литературы

1. Пат. N 4517290, МКИ G 01 N 33/54 (США).

2. Заявка N 0158973, МКИ G 01 N 33/543 (ЕПВ).

3. Заявка N 084/04598, МKИ G 01 N 33/54 (РCТ).

4. Shmidt M.А. Biotech.Adv. 1989, V.7, р.187-213.

5. Mitchell A. R. Kent S.B.H. Engelhard M. Merrifield R.B. J.Org.Chem. 1978, v.43, p.2845-2852.

6. Dryland A. and Sheppard R.S. J.Chem.Soc. Perkin Trans.I, 1986, p. 125-133.

7. Ястребов С.И. Дедкова Л.М. Фролова С.Б. и др. Биотехнология, 1991, N 3, с.43-45.

8. Kurstak Е. Tijssen Р. Kurstak С. In: Applied Virology, Acad. Press, N.-Y. 1984, p.479-503.

9. Farkar P. J. Speck J. C. In: Pierce Handbook and General Catalog 1977-1978, p.96.