способ получения гонадотропина, обладающего активностью фолликулостимулирующего гормона, из постменопаузной мочи (мочевого концентрата)

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГОНАДОТРОПИНА, ОБЛАДАЮЩЕГО АКТИВНОСТЬЮ ФОЛЛИКУЛОСТИМУЛИРУЮЩЕГО ГОРМОНА, ИЗ ПОСТМЕНОПАУЗНОЙ МОЧИ (МОЧЕВОГО КОНЦЕНТРАТА), включающий иммунохроматографию, элюирование с последующим концентрированием целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения специфической активности целевого продукта, иммунохроматографию проводят с использованием фолликулостимулирующих гормонов специфических иммобилизованных моноклональных антител, эллюируют целевой продукт водным раствором pH 10 13, очищают путем жидкостной хроматографии высокой разрешающей способности с обращенной фазой с последующим элюированием градиентом изопропанола до 50% подвижной фазы.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что элюирование осуществляют 0,8 - 1,0 М раствором аммиака при pH 11,3 11,7.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к мочевому фолликулостимулирующему гормону, фармацевтическим композициям, содержащим его, и способу его очистки.

Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ), как известно, пригоден при лечении бесплодия. Препараты, содержащие данный гормон, используются для содействия в протекании беременности с использованием методов in vitro и in vitrо. Человеческий ФСГ выделен из гипофиза и постклимактерической мочи человека. Совсем недавно ФСГ получен с использованием методик рекомбинантной ДНК.

Первый коммерчески доступный продукт, включающий человеческий ФСГ, содержал ЧМГ (например, Пергонал^(R) Сероно), т.е. человеческий менопаузный гонадотропин, экстрагированный из постклимактерической мочи, представляющей собой смесь ФСГ, лютеинизирующего гормона (ЛГ) и других мочевых белков. Между тем были сделаны попытки получить чистые ФСГ-препараты как для научных, так и для терапевтических целей. Продукт Метродин^(R) (Сероно), в настоящее время доступный в торговле, представляет собой препарат мочевого ФСГ, содержащий другие мочевые белки, однако минимальные количества ЛГ, и используется для лечения бесплодия. Применение данного продукта особенно благоприятно, когда нежелательно вводить экзогенный ЛГ вместе с ФСГ, например, при синдроме поликистоза яичников (СПЯ).

До сир пор введение ФСГ для терапевтических целей осуществляли, и успешно, исключительно путем внутримышечной инъекции. Поскольку внутримышечные инъекции, как правило, осуществляют врачи или люди из числа профессиональных медиков, пациенту приходится посещать хирургический кабинет или больницу регулярно с тем, чтобы получить лечение. Это создает значительное неудобство. Кроме того, время, необходимое для осуществления данного типа введения лекарственных веществ, часто является причиной неудовольствия, выражаемого пациентами в связи с тем, что лечение обычно растягивается на несколько недель или даже месяцев.

Введение путем подкожной инъекции могло бы позволить осуществить самовведение пациентам и, следовательно, повысить содействие и готовность пациентов в лечении.

Подкожное введение человеческого менопаузного гонадотропина (ЧМГ) было описано (Накамура Й. и др. Плодовитость и бесплодие, 46 (1), стр. 46-54, 1986) в связи с лечением женского бесплодия путем пульсирующего введения ЧМГ посредством подкожного перистальтического насоса. Подкожное введение может сопровождаться таким недостатком, как местная аллергия, вследствие наличия примесей в используемом продукте и, следовательно, может привести к приостановке лечения.

П. Пауз ("Человеческий фолликулостимулирующий Гормон", Acta Endocrinologica Supplementum, 131, 1968) описал и охарактеризовал высокоочищенные препараты гипофизарных и мочевых ФСГ, полученные из замороженных гипофизов и из постклимактерического мочевого концентрата соответственно. Биологические активности составляют около 14000 международных единиц активности ФСГ на мг для гипофизарного ФСГ и 780 международных единиц активности ФСГ на мг для мочевого ФСГ. Содержание контаминации ЛГ в большинстве активных гипофизарных и мочевых препаратов, как ожидается, соответствует, приблизительно, 0,1% по массе. Методики очистки включают один или более таких способов, как хроматография на диэтиламиноэтилцеллюлозе, гельфильтрация на Сефадексе G-100, гидроксилапатитовая хроматография, электрофорез в полиакриламидном геле и подобное.

Один из наиболее очищенных препаратов ФСГ был описан Донини и др. ("Очистка и частичное химико-физическое исследование ФСГ из Климактерической Мочи", Гонадотропины и Яичниковое развитие (Труды двух рабочих встреч), Е и С Ливингстон, Эдинбург и Лондон, 1970) и имел биологическую активность 1255,6 международных единиц ФСГ на мг при контаминации ЛГ до 3,2 международных единиц ЛГ на мг. В данном случае исходным материалом являлся человеческий климактерический гонадотропин (ЧКГ) в виде препарата Пергонал^(R), который, как указано выше, представляет собой смесь ФСГ и гормона ЛГ, а также других мочевых белков. Этот результат был достигнут периодической очисткой исходного ЧКГ на диэтиламиноэтилцеллюлозе с последующей хроматографией на колонке диэтиламиноэтилцеллюлозы, гельфильтрацией на Сефадексе G-100 и конечной стадией препаративного полиакриламидного гель-электрофореза.

Даже более высокие активности были достигнуты Х. ван Хеллом и др. ("Очистка и некоторые свойства человеческого мочевого ФСГ и ЛГ", Гонадотропины (Труды I-го международного симпозиума по Гонадотропинам, 1971), Уили-Интерсайенз, Нью-Йорк) путем добавления стадий иммунохроматографии и гель-фильтрации к традиционному методу хроматографической очистки. Иммунохроматографию осуществляли с использованием анти-хорионический гонадотропин человека (анти-ХГЧ)-антител, связанных с Сефарозой для специфической цели удаления активности ЛГ из частично очищенных фракций ФСГ. Наиболее очищенная фракция ФСГ содержала 4720 международных единиц ФСГ на мг, контаминация ЛГ составила всего 15 международных единиц ЛГ на мг, как испытано радиоиммуноанализом.

Иммунохроматографический подход описан Донини и др. ("Очистка и Выделение ФСГ и ЛГ из ЧКГ", Acta Endocrinologica 52, стр. 186-198, 1966), которые еще в 1966 году получили препарат ФСГ, имеющий активность 329,7 международных единиц ФСГ на мг и биологически необнаруживаемые количества контаминации ЛГ. В другом эксперименте были получены активности фракции, составляющие значение 148,3 международных единиц ФСГ на мг и 2,4 международных единиц ЛГ на мг. Поскольку никакого радиоиммуноанализа не было проведено относительно препарата с активностью 329,7 международных единиц ФСГ на мг, можно предположить по аналогии с результатами Х. ван Хелла (см. выше), что при радиоиммуноанализе (РИА) могут быть обнаружены следовые количества ЛГ.

Физиологическая релевантность даже минимальных количеств контаминации ЛГ была показана Донини и др. в работе ("Новый подход к Биологическому определению Лютеинизирующего гормона", Acta Endocrinologica 58, сс. 463-472, 1968), где предложено новое количественное определение биологической активности ЛГ, состоящее в введении интактным незрелым мышам постоянной дозы биологически чистого препарата ФСГ при возрастающих количествах ЛГ с последующим измерением повышения маточной массы как ответ, пропорциональный активности ЛГ. При данном методе всего 0,068 международных единиц ЛГ способны повышать маточную массу при введении вместе с 4,44 международных единиц ФСГ.

Поэтому следует, что желательно иметь абсолютно чистый препарат ФСГ, когда при лечении требуется активность ФСГ при полном отсутствии активности ЛГ.

Как упомянуто выше, поставляемый в настоящее время продукт Метродин^(R) (Сероно) представляет собой очищенный препарат ФСГ, который получен методом по существу идентичным тому, который описан Донини и др. в упоминаемой работе (Acta Endocrinologica, 52, стр. 186-198, 1966). Технические требования контроля качества в согласии с заявленной биологической чистотой указанного препарата обеспечивают не более 0,7 международных единиц ЛГ на 75 международных единиц ФСГ, т.е. приблизительно, предел чувствительности биологической пробы на активность. В некоторых терапевтических применениях, однако, желательно абсолютное отсутствие ЛГ, Кроме того, в Метродине^(R) человеческий ФСГ сопровождается значительными количествами других мочевых белков, т.е. это не химически чистый препарат ФСГ.

Заявка на патент Великобритании N 2173803А предлагает еще один подход к очистке гипофизарных гликопротеидных гормонов, среди них ФСГ. Этот подход состоит в образовании комплекса гормона с иммобилизованными моноклональными антителами с последующим элюированием гормона кислотным водным буфером, имеющим рН 3-4. Что касается ФСГ, то полученный высокоочищенный гормон все же загрязнен 0,1% по массе ЛГ и 0,5% по массе тиреостимулирующего гормона (ТСГ).

Скотт К. Чаппел и др. описали в обзорной статье (Эндокринные обзоры, 4/2), стр. 179-211, 1983) микронеоднородность ФСГ и физиологическое значение углеводородных частей, сопровождающих молекулу ФСГ. Можно построить гипотезу, что некоторые модификации встречаются во время пути метаболизма вплоть до конечной мочевой секреции, что можно объяснить химико-физической дифференциацией, представленной в экспериментах, проводимых заявителем между высокоочищенным препаратом мочевого ФСГ (вомФСГ) в соответствии с настоящим изобретением и высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, используемым для целей сравнения.

Со- или посттрансляционные модификации, по-видимому, являются основой для микрогетерогенного разнообразия ФСГ, гликопротеида, состоящего из двух различных, гликозилированных, не ковалентно связанных полипептидных цепей, известных как альфа и бета-субъединица. Бета-субъединица наделяет молекулу ее биологической специфичностью.

Данная статья пытается объяснить существенную разницу в значениях биологической активности на мг между выскооочищенными гипофизарными и мочевыми препаратами ФСГ. Гипотеза вновь может основываться на релевантности углеводородных частей и, более конкретно, роли концевых остатков сиаловой кислоты.

Следует отметить, что несмотря на то, что и гипофизарный ФСГ, и мочевой ФСГ называются "ФСГ", еще не обнаружено никакого неопровержимого доказательства, подтверждающего являются ли молекулы, выделенные из двух источников, одинаковыми или даже химическими эквивалентными.

Обнаружено, что человеческий мочевой ФСГ может быть выделен из концентрата постклимактерической мочи с такой степенью чистоты, что полученный ФСГ совершенно свободен от любых обнаруживаемых следовых количеств ЛГ и других мочевых белков. Аминокислотный анализ мочевого ФСГ в соответствии с настоящим изобретением выявил новую бета-субъединицу ФСГ из Ш аминокислот вместо 118 или 108, как приводится в известном уровне знания (см. например, Скотт и др. выше) для известной бета-субъединицы ФСГ. Более конкретно, настоящее изобретение предлагает новую бета-субъединицу ФСГ, аминокислотная последовательность которой имеет следующий вид:

Asn Ser Cys Clu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys

Glu Clu Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys

Ala Glu Tyr Cys Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro

Ala Arg Pro Lys Ile Gln Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu

Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro Gly Cys Ala His His Ala

Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gln Cys His Cys

Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val Arg Gly

Leu Glu Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu

а также новый белок, содержащий новую альфа-субъединицу гонадотропина и бета-субъединицу из Ш аминокислот, приведенных выше. Белок имеет биологическую активность фолликулостимулирующего гормона (ФСГ). Предпочтительно, он находится в гликозилированной форме. Наиболее предпочтительно, он в основном свободен от обнаруживаемых следовых количеств лютеинизирующего гормона и других мочевых белков.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая очищенный белок в соответствии с настоящим изобретением и фармацевтически приемлемый наполнитель. Предпочтительно, композиция находится в форме, пригодной для подкожного введения. Обнаружено, что подкожное введение фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением не приводит к возникновению тех аллергических реакций, которые обычно сопровождают применение известных препаратов ФСГ.

В соответствии с другим вариантом настоящего изобретения предлагается способ получения нового и высокоочищенного ФСГ в соответствии с настоящим изобретением. Способ в основном базируется на комбинации стадии иммуноочистки с жидкостной хроматографией высокого давления с обращенной фазой. Стадии иммуноочистки использует иммобилизованные моноклональные антитела, по существу, как описано в вышеупомянутой заявке на патент Великобритании N 2173803А, однако с фундаментальным отличием, заключающемся в том, что элюирование ФСГ из иммунокомплекса осуществляют при более высоких значениях рН.

В способе настоящего изобретения элюирование удобно осуществлять с использованием водного раствора, имеющего рН выше, приблизительно 10, и молярности выше, приблизительно 0,5. Проведенные эксперименты показали, что при таких условиях иммобилизованное антитело в основном не инактивируется.

В соответствии с настоящим изобретением рН элюента, предпочтительно, выше 11 и, более предпочтительно, составляет интервал 11,3-11,7.

Значения молярности, предпочтительно, выше 0,8, и, более предпочтительно, около 1.

Пригодными элюентами для использования в способе изобретения являются аммиак, диэтиламин и такие буферы, как ТРИС-буфер, глицин-NaOH и подобное.

Последующая стадия жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой (ЖХВД) позволяет достичь полного удаления любых загрязняющих белков. Данное удаление не достигается только стадией иммуноочистки. То, что такая стадия не только эффективно удаляет остаточные следовые количества загрязняющих белков, но также сохраняет полную биологическую активность ФСГ, является неожиданным в свете статьи, написанной П. Халлином и С. А. Ханом (J. Lig Chromat. 9 (13), стр. 2855-2868, 1986), которая показывает потерю биологической активности для бычьего ФСГ и для человеческого ФСГ (стандарт ЧКГ), когда они подвержены ЖХВД с обращенной фазой. С другой стороны, в той же статье показывается удовлетворительное восстановление биологической активности, однако только частичное разделение, когда человеческий мочевой препарат (т.е. содержащий как ФСГ, так и ЛГ) подвергают ионообменной ЖХВД.

После стадии жидкостной хроматографии высокого давления с обращенной фазой ФСГ восстанавливают с использованием традиционных методик. Для целей хранения и/или манипулирования продукт может быть лиофилизирован. Предполагаются также и другие пригодные методики с целью осуществления концентрации, стабилизации или другой обработки продукта.

Безусловно, что доступность постклимактерической мочи намного выше, чем доступность человеческого гипофиза. Эта относительная доступность придает яркий характер заявленному изобретению.

ФСГ-специфическое моноклональное антитело для использования в способе настоящего изобретения может быть получено с применением известных приемов.

В типичном примере линию клеток гибридомы 9/14 подвергают скринингу на оптимальное сродство к ФСГ в Университете Кембридж. Моноклональные антитела продуцируют в среде супернатанта методами культивирования клеток и очищают при помощи солевого фракционирования, используя 50% (в отношении веса к объему) сульфат аммония, с последующей ионной хроматографией с обращенной фазой и ЖХВД гель-фильтрацией и диализом.

Моноклональное антитело, продуцируемое линией клеток 9/14 и очищенное, как описано выше, имеет следующие технические требования:

а) чистота белка: не менее, чем 90%

б) класс иммуноглобулина: IgG 1

в) константа сродства: 3,5 x 10⁸ лмоль^-1

г) специфичность:

Антиген Поперечной

реакции ФСГ 100 ХГТ 1 ХГГ-бета-субъединица 1 ЛГ 1 ТСГ 1

д) связывающая способность с ФСГ в растворе: около 1000 международных единиц ФСГ на мг McAb.

ФСГ-специфические моноклональные антитела химически связываются с Сефарозой 4В посредством дивинилсульфона в соответствии с методом, описанным Дж. Поратом в журнале "Методы в ферментологии", 34, стр. 13-30, 1974.

В типичном примере 1 л Сефарозы 4В промывают на пористом стеклянном светофильтре вначале 5 л свежедистиллированной воды и затем 5 л 1 М раствора карбоната натрия, рН 11. Промытую Сефарозу суспендируют в 1 л 1 М раствора карбоната натрия (рН 11). При непрерывном перемешивании по каплям прибавляют 200 мл дивинилсульфона. Реакцию завершают в течение 70 минут при комнатной температуре и затем прекращают путем прибавления 1 н.раствора НСl (рН до 7,0).

Активированную смолу суспендируют в 1 л 0,25 М раствора бикарбоната натрия (рН 9,0), содержащего 2 г анти-ФСГ моноклонального антитела, с получением более чем 90% связывания антитела с активированной смолой. Полученную иммуносмолу хранят при 4^оС.

Далее описываются две стадии способа настоящего изобретения, приемлемые для коммерческого ЧКГ, т.е. активного ингредиента в препарате Пергонал^(R) Сероно.

Следует понять, что хотя ЧКГ является предпочтительным исходным материалом в способе настоящего изобретения, последний также приемлем в отношении менее очищенных материалов, таких, как постклимактерические мочевые концентраты и тому подобное. Хорошие результаты получены с использованием в качестве исходного материала мочевого концентрата, содержащего всего 1 международную единицу ФСГ на мг.

П р и м е р 1. Получение высокоочищенного мочевого ФСГ (вом ФСГ).

Стадия I: иммуноочистка анти-ФСГ МсАв-ДВС-Сефарозы.

ЧКГ используют в качестве исходного материала.

Иммуносмолу анти-ФСГ Мсаb-ДВС-Сефарозу уравновешивают в 0,1 М Трис-НСl, 0,3 М NaCl-буфере, рН 7,5 при температуре 4^оС. Колонку нагружают определенным количеством международных единиц ФСГ (РИА), соответствующим 80-90% общей связывающей способности ФСГ.

Неудерживаемые белки элюируют уравновешивающим буфером до тех пор, пока OD₂₈₀ элюата не станет ниже, чем 0,02.

Абсорбированный мочевой ФСГ элюируют из иммуносмолы 1 М раствором аммиака при 4^оС, Аммиачные элюаты, соответствующие, приблизительно, 4-кратному объему иммуносмолы, группируют, рН доводят до 9,0, как можно скорее, при температуре 4^оС путем прибавления ледяной уксусной кислоты, и раствор ультрафильтруют в аппарате Амикон (мембрана С.О. 10000 дальт) и концентрируют до малого объема.

Стадия 2. Жидкостная хроматография высокого давления с обращенной фазой

Полученный раствор, доведенный до рН 5,6, загружают в колонку С₁₈ с обращенной фазой Pre Pak Waters, которую предварительно уравновешивают 0,05 М буферным раствором уксуснокислого аммония при комнатной температуре. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 100 мл/мин, и элюат записывают при 280 нм.

Очистку с использованием ЖХВД осуществляют с использованием аппарата Prep 500 А (Waters), оборудованного УФ-детектором и генератором препаративного градиента.

Биологически активный, высокоочищенный мочевой ФСГ элюируют градиентом изопропанола до 50% подвижной фазы. Фракции проверяют аналитической гель-проникающей хроматографией и радиоиммуноанализом.

Органический растворитель удаляют дистилляцией в вакууме при 40^оС, после чего раствор заморживают и лиофилизируют.

П р и м е р 2. Исследование ФСГ.

Высокоочищенный препарат мочевого ФСГ настоящего изобретения подвергают нескольким химико-физическим, биологическим и иммунологическим испытаниям с тем, чтобы получить его полную характеристику. Большинство испытаний осуществляют в сравнении с высокоочищенным препаратом гипофизарного ФСГ, полученным в соответствии с методом, описываемым ниже.

В качестве исходного материала используют неочищенный человеческий гипофизарный экстракт (НРG), побочный продукт, полученный из экстракции человеческого гормона роста.

Методика заключается в осуществлении следующих стадий:

1) Предварительной очистки сырого HPG путем экстракции 40%-ным этанолом, содержащим 6% уксуснокислого аммония, рН 5,6 и преципитации супернатанта с помощью 96%-ного холодного этанола.

2) Дальнейшей очистки НРG ионообменной хроматографией на диэтиламиноэтилцеллюлозе с использованием 0,15 М раствора ацетата натрия, рН 7,0, в качестве элюента, с последующей преципитацией 96%-ным холодным этанолом.

3) Дальнейшей очистки фракции гель-фильтрацией на Сефадексе G-100 с использованием 0,05 М бикарбоната аммония в качестве буфера.

4) Последней стадии очистки ФСГ ионообменной хроматографией на колонке SP Сефадекс С 50. Высокоочищенный гипофизарный ФСГ элюируют 0,1 М фосфатным буферным раствором, рН 6,2. и лиофилизируют.

Как определено, биологическая удельная активность in vitro гипофизарного ФСГ (тест Стилмана-Ролей; международная единица второго IRP-HMG) составляет 4770 международных единиц ФСГ на мг лиофилизованного порошка. Для этого определения используют методику, описанную ниже под заголовком "Количественное определение биологической активности".

Контаминация ЛГ. Данный тест осуществляют при помощи специфического радиоиммуноанализа для ЛГ (лютеинизирующего гормона) с использованием стандарта ЛГ, градуированного с помощью второго IRP-ЧКГ и ¹²⁵I-ЛГ в качестве меченого атома, оба которые содержат в ЛГ тройной КIТ (код 10204), поставляемый в настоящее время на рынок компанией Биодата^(R). В качестве антисыворотки используют овечью анти- ХГГ (хорионический гонадотропин человека) антисыворотку, полученную заявителем, которая имеет 100%-ную перекрестную реакционную способность к ЛГ и менее, чем 0,1% к ФСГ.

Методу радиоиммуноанализа в соответствии с наставлениями изготовителя придерживаются с тем, чтобы не было получено никакого загрязнения ЛГ, обнаруживаемого в высокоочищенном препарате мочевого ФСГ, полученном в соответствии с примером 1.

Вышеприведенные результаты подтверждают с использованием более чувствительного анализа, называемого DELFIA (диссоциация улучшенный лантанид-фторо-иммуноанализ), оборудование для проведения которого поставляется фирмой ЛКБ-Фармация.

ПААГ в ДДС-Na. Блочный электрофорез в плоском геле в додецилсульфате натрия осуществляют в восстановительных условиях на 13,5%-ном полиакриламидном геле, рН 8,8, в соответствии с методикой, описанной Лаеммли в Нэйчур, 227, стр. 680-685 (1970).

Окрашивание осуществляют синим блестящим кумасси R-250, 0,25% в 25% метаноле (75% уксусная кислота.

Данному испытанию подвергают как препарат вомФСГ в соответствии с настоящим изобретением, так и высокоочищенный препарат гипофизарного ФСГ (вогФСГ), полученный как описано выше.

В обоих препаратах мФСГ и гФСГ основная большая полоса, типичная для гликопротеидов, обнаруживается при одной и той же молекулярной массе, приблизительно, 20000 дальтон, что также соответствует литературным данным. Вследствие известного поведения гликопротеидов в ПААГ в ДДС-Na это значение слегка преувеличено.

Вытеснительная хроматография.

Анализы как вом ФСГ, так и вогФСГ осуществляют на колонке ТSK S 2000 SW посредством ЛКБ с использованием 0,1 М буферного фосфатного раствора, рН 6,8 + 0,2 М NaCl в качестве элюента. Скорость перемещения фронта растворителя составляет 0,7 мл/мин, и считывания выполняют при длине волны 230 нм.

Изоэлектрофокусирование.

Изоэлектрофокусирование осуществляют на 5%-ном тонкослойном полиакриламидном геле (Анфолин ЛКБ (R), рН 3,5-9,5), закрепленном в 11,5%-ной (мас.) три- хлоруксусной кислоте и 3,5-ной (мас.) сульфосалициловой кислоте, и окрашивают Серебряным окрашивающим набором БИО-РЭД^(R).

Мочевые и гипофизарные ФСГ не являются идентичными молекулами, а также то, что различия заключаются, по крайней мере, в их углеводородных частях, если не в самих белковых частях.

Количественное определение биологической активности.

Биологическую активность in vivo ФСГ высокоочищенного мочевого ФСГ определяют методом Стилмана-Ролей (Эндокринология, 53, стр. 604-616, 1953) с исполь- зованием в качестве эталонного вещества ЧКГ-Хаус Эталон, градуированный по 2-му Международному Эталонному препарату ЧКГ для количественного определения биологической активности. Данный анализ принят всеми основными фармакопеями и службами здравоохранения для определения международных единиц (1.U.) биологической активности ФСГ.

Как определено, вом ФСГ-препарат, полученный в соответствии с примером выше, имеет удельную активность, равную 6200 I. U. ФСГ на мг лиофилизированного порошка, т.е. наиболее высокую удельную активность, когда-либо описанную для мочевого препарата ФСГ.

Определение аминокислотной последовательности.

а) Выделение субъединиц мочевого ФСГ.

Выделение субъединиц мочевого ФСГ осуществляют с использованием системы ЖХВД Waters, оборудованной колонкой Аквапор RP-300, 200 х 4,6 мм, 7 мкм, (Браунли Лэбз). Элюентами являются А 0,1% ТFA (трифторуксусная кислота, классификация ЖХВД, Пиерс.), В 0,055% TFA в ацетонитриле. Скорость перемещения фронта растворителя составляет собой 15% В. Градиент повышает на 40% В в течение 20 мин. УФ-детектор устанавливают на 229 нм. Обычно вводят аналитические серии 20 мкл раствора 0,5 мг/мл вом ФСГ и 0,5% ТFA. Предварительная инкубация в растворе ТFA необязательна. Препаративное разделение осуществляют с использованием той же колонки. Хорошее разрешение достигают путем ввода 0,5 мг высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ (серия N 032), растворенных в буфере А. Фракции собирают вручную и сушат с использованием концентратора Спид Вак. Субъединицы растворяют в воде, анализируют ЖХВД, и хранят при температуре -20^оС.

Бета-субъединицу элюируют, приблизительно, через 10,5 мин в качестве широкого пика, альфа-субъединицу элюируют в течение 15 мин в качестве резкого пика. Узнавание каждого пика в качестве бета- и альфа-субъединицы соответственно осуществляют специфическим радиоиммуноанализом. Обычно восстановление бета-субъединицы происходит вокруг значения 50% напротив, восстановление альфа-субъединицы составляет значение более, чем 90%

б) Восстановление и карбоксиметилирование альфа- и бета-субъединиц.

Восстановление субъединиц, разделенных как описано выше, осуществляют в 0,5 Трис, 0,1% ЭДТК, 6 М гуанидин-HCl, рН 8,5, в течение 2 ч при 37^оС с использованием ДТТ (дитиотрейтола, Серва) при 15-кратном полярном избытке перед содержанием цистеина. Затем в реакционную смесь прибавляют йодоацетат натрия (2,1 молярный перед ДТТ) и оставляют на 30 мин в темноте. Для прекращения реакции прибавляют 1%-ный меркаптоэтанол и ТFA. Карбоксиметилированные субъединицы очищают ЖХВД. Бета-карбоксиметилированная субъединица плохо растворяется в воде так, что конечный выход совершенно незначителен.

в) Восстановление, пиридилэтилирование и трипсин-переваривание бета-субъединицы.

Восстановление бета-субъединицы, разделенной как описано выше, осуществляют при комнатной температуре в течение 2 ч следующим образом: 0,1 мг бета-субъединицы, 0,5 мл 0,5 М раствора Трис, 0,1% ЭДТК, 6 М гуанидин-HCl, рН 8,5, 2,7 мг дитиотрейтола. Пиридилэтилирование осуществляют путем прибавления 0,02 мл 4-винилпиридина к предыдущему раствору. Реакция продолжается в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь загружают в С4-патрон (Бэйкер), уравновешенный 0,1% ТFA. Патрон промывают 0,1% ТFA и пиридилэтилированную бета-субъединицу элюируют 40% ацетонитрилом, 0,1% TFA. Элюированные фракции сушат и очищают ЖХВД как описано выше для бета-субъединицы. Пиридилэтилированную бета-субъединицу, очищенную ранее путем ЖХВД, растворяют в 1%-ном растворе NH₄HCO₃, pН 8.

В раствор прибавляют трипсин и реакцию осуществляют в течение 1,5 ч при 37^оС. Триптические фракции очищают жидкостной хроматографией высокого давления (ЖХВД) с использованием ранее описанной методики за исключением того, что градиент поднимают от 0% до 55% в течение 30 мин и УФ-детектор устанавливают на 214 нм.

Триптические фракции секвенируют таким же образом, как осуществляют секвенирование субъединиц (см. часть д)).

г) Секвенирование альфа-субъединицы

Несколько испытаний на определение последовательности аминокислотных остатков в белках (секвенирование) осуществляют с использованием альфа-субъединицы, карбоксиметилированной альфа-субъединицы или целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ, обычно загружая 5 нмоль или менее в белковый секвенсер (470 А, Эпплайд Биосистем) и используя стандартную программу ОЗРРТН, поставляемую Эпплайд Биосистем, или специальную программу, в которой циклы, которые расщепляют PrO или Gly, замещены специальным циклом ОЗСРRО. Первые 45 остатков, начиная с NH₂-конца молекулы, идентифицируют, что приводит к результатам, подтверждаемым аминокислотной последовательностью, известной из литературы (T. Biol. Chem. 250, стр. 6735 (1975). Asn в положении 52 и в положении 78, относящиеся к известной последовательности, начинающейся с Ala, представляют собой аминокислоты, где происходит гликоэилирование. На конце NH₂ всегда присутствует неоднородность и она всегда одна и та же во всех секвенированных пробах. Полная молекула (т.е. начинающаяся с Ala) присутствует в количестве 65% цепей, молекула, не имеющая первые две аминокислоты (т.е. начинающаяся с Asp), присутствует в количестве 5% молекула, не имеющая первых три аминокислоты (т.е. начинающаяся с Val), присутствует в количестве 30%

65% цепей Ala Pro Asp Val Cln

5% цепей Asp Val Cln

30% цепей Val Gln

Неоднородность альфа-субъединицы.

Осуществляют несколько серий секвенирования с использованием бета-субъединицы, карбоксиметилированной бета-субъединицы, целого высокоочищенного человеческого мочевого ФСГ и триптических пептидов из пиридилэтилированной бета-субъединицы. Образцы загружают в секвенсер белков (470, А, Эпплайд Биосистем) с использованием стандартной программы ОЗRPTH, предложенной Эпплайд Биосистем. Результаты показывают, что данная субъединица имеет длину Ш аминокислот и следующую аминокислотную последовательность:

Asn Ser Cys Gly Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile

Glu Lys Glu Gly Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn

Thr Thr Тrp Cys Ala Gly Tyr Cys Thr Arg Asp

Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln

Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr

Val Arg Val Pro Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser

Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr Gln Cys His Cys

Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val

Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu

Met Lys Glu

Asn в положении 7 и 24, относящихся к вышеприведенной последовательности, начиная с Asn в положении I, представляют собой аминокислоты, где происходит гликозилирование.

В конце NH₂ бета-субъединицы всегда присутствует неоднородность, и она всегда одна и та же во всех секвенированных образцах. Полная молекула (т.е. начинающаяся с Asn) присутствует в количестве 35% цепей, молекула, не имеющая первые аминокислоты (т.е. начиная с Ser) присутствует в количестве 15% молекула, не имеющая первые две аминокислоты (т.е. начинающаяся с Cys), присутствует в количестве 50%

35% цепей Asn Ser Cys Gly Leu

15% цепей Ser Cys Gly Leu

50% цепей Cys Gly Leu

Неоднородность бета-субъединицы.

П р и м е р 3. Фармацевтические препараты.

Получение фармацевтических лекарственных форм, содержащих высокоочищенный мочевой ФСГ, полученный в соответствии с настоящим изобретением, не представляет трудности. Поскольку вещество сохраняет свою биологическую активность после лиофилизации, последняя содействует получению предпочтительной формы для инъецируемых препаратов.

Лиофилизированный препарат, содержащий вом ФСГ, воссоздают с использованием физиологического раствора и/или других пригодных разбавителей, с получением инъецируемого раствора.

Некоторые наполнители могут быть пригодно использованы в композиции в качестве ее части, такие, как например, маннит, лактоза, глицин, глюкоза, сахароза и их смеси. Могут быть использованы и другие традиционные носители, наполнители и тому подобное. Операбельны и смеси.

В экспериментах, проводимых в соответствии с настоящим изобретением, лактозу использовали в качестве наполнителя для инъецируемых препаратов.

При получении инъецируемых составов рН необязательно доводят до определенного значения путем прибавления традиционных кислотных или основных веществ. Кислотные вещества включают уксусную кислоту и тому подобное. Основные вещества включают гидроокись натрия и тому подобное. Могут быть использованы смеси.

Предполагается использование одного или более стабилизаторов, например, альбумина и тому подобного.

Типичный пример фармацевтического производства для изготовления партии 20000 ампул, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ, представляет собой следующее.

Вычисленное количество (в единицах биологической активности) насыпного порошка лиофилизированного ФСГ растворяют в 700 мл холодной апирогенной воды для инъекции. Если необходимо, рН доводят до значения между 6,2 и 6,8 с использованием либо уксусной кислоты, либо гидроокиси натрия, в зависимости от случая. Затем раствор подвергают стерильной фильтрации через фильтр с размером пор 0,2 мкм.

200 г лактозы растворяют в 2 л апирогенной воды для инъекции, подвергают стерильной фильтрации как описано выше и прибавляют к раствору ФСГ.

Апирогенную воду для инъекции прибавляют для того, чтобы достичь конечный объем, равный 15 л, раствор разливают в ампулы (0,75 мл каждая) и лиофилизируют в стерильном лиофилизаторе. Получают ампулы, каждая из которых содержит 75 международных единиц ФСГ и 10 мг лактозы.

В предпочтительном варианте каждая ампула может содержать 150 международных единиц ФСГ и 10 мг лактозы.

В соответствии с другим примером фармацевтического препарата ампулы получают с содержанием в каждой 1 мг человеческого альбумина в качестве стабилизатора, кроме лактозы в качестве наполнителя.