способ получения антигенного препарата для определения антикардиальных антител

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИКАРДИАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ иммунофлуоресцентным методом путем обработки ткани сердечной мышцы, отличающийся тем, что обработку проводят методом ультразвуковой денентеграции, смесь концентрируют и вносят акриламид, метиленбисакриламид и магнитный материал в соотношении 3 : 1 : 2 соответственно.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунодиагностике, и может найти применение в биотехнологии.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ определения антикардиальных антител (АКА) иммунофлюоресцентным методом с использованием в качестве антигенного материала гистологических срезов сердечной ткани [1]

Однако этот метод имеет ряд ограничений: недостаточная чувствительность, длительная постановка реакции (48 ч), однократное применение антигенного материала, субъективность оценки результатов, затруднения при массовом обследовании населения. Основным недостатком метода является то, что в реакции непрямой иммунофлюоресценции участвуют только поверхностные клеточные антигены. Применение ультразвукового дезинтеграта сердца крысы с последующей его иммобилизацией в полиакриламидный гель (ПААГ) позволяет освободить глубоколежащие антигенные структуры и использовать его в реакции непрямой иммунофлюоресценции.

Цель изобретения повышение антигенной активности препарата.

Поставленная цель достигается за счет замены срезов сердца лабораторных животных препаратом иммобилизированного гранулированного сердечного материала с магнитными свойствами, который получают путем включения ультразвукового дезинтеграта сердца белой крысы в структуру ПААГ, что позволяет прочно фиксировать эти биополимеры, стабилизировать их с сохранением биологических свойств. Полученный носитель инертен, устойчив к физико-химическому и биологическому воздействиям, что позволяет длительно хранить его.

Получение гранулированного препарата осуществляется в потоке газообразного азота за счет создания эмульсии вода в масле с включением магнитного материала окиси железа с размером частиц 0,05-5 мкм. Использование одной партии гранул препарата со стандартной сферической формой и включением магнитного материала стандартизирует результаты исследования, облегчает манипуляции с ним.

Получение препарата с иммобилизированным антигенным материалом для определения АКА и постановка реакции иммунофлюоресценции с ним поясняется следующими примерами:

П р и м е р 1: Получение ультразвукового дезинтеграта.

Ультразвуковой дезинтеграт ткани сердца белой крысы, содержащий весь комплекс антигенов, получали на приборе МСЕ при 20 кГц и t -4^оС, после чего его концентрировали через полупроницаемую мембрану SM 132000 фирмы Sartomus (ФРГ) с применением вакуумного насоса.

П р и м е р 2. Иммобилизация комплексного антигенного материала в структуру ПААГ.

В 2 мл водорастворимого комплексного материала сердечной ткани растворяли соответственно 100 и 300 мг метиленбисакриламида и акриламида.

В сосуд, содержащий 100 мл гексана и 0,5 мл СПЕН-85, подавали под давлением 0,2-1 атм газообразный азот по трубке, сечением 0,8 мм таким образом, чтобы создать интенсивное перемешивание в течение 5 мин. В колбу для полимеризации вносили 1 мл забуференного физиологического раствора (ЗФР), 200 мг окиси железа с гидрофильными свойствами и 10 мг персульфата аммония и через 1-2 мин добавляли 2 мл дезинтеграта с растворенными мономерами и 20 мкл NN, N"N"- тетраметилэтилендиамина (ТЭМЭД). После завершения полимеризации в течение 10-15 мин гранулы отмывали ацетоном и ЗФР с твин-20 (0,5%) 3-5 раз и инкубировали 30 мин в 1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина для исключения неспецифического взаимодействия во время постановки реакции. Полученные гранулы имели стандартную сферическую форму с размерами 10-100 мкм, препарат хранили в ЗФР с 0,01% формалина. Из полученных гранул готовится 10% -ная взвесь. Постановку реакции осуществляли в пробирках или планшетах из расчета 20 мкл 10% взвеси гранул на одну пробу.

П р и м е р 3. Постановка реакции иммунофлюоресценции на иммобилизированном гранулированном антигенном препарате для определения АКА.

Для отмывки от консерванта в лунку планшета вносили 0,5 мл ЗФР и добавляли 20 мкл 10%-ной взвеси гранул, ЗФР отсасывали и затем вносили 0,1 мл исследуемой сыворотки в разведении 1:10 и инкубировали в течение 30 мин при 37^оС. После этого сыворотку удаляли и гранулы трижды промывали ЗФР с твин-20 (0,05% ) и трижды простым ЗФР. Выявление специфических антител осуществляли коммерческой видовой люминесцирующей сывороткой. После инкубации 30 мин при 37^оС гранулы отмывали в последовательности, описанной выше. Выявление уровня свечения микрогранул осуществляли с помощью люминесцентного микроскопа, снабженного фотометрической приставкой ФМЭЛ-IА. К насадке подключали источник тока УБПВ-1 и цифровой вольтметр Щ-4300. Работу проводили при напряжении 1800 В, светофильтры возбуждения света СЭС 24-4, СС-15-4, интерференционный светофильтр фотометрической насадки МАХ-525 НМ. Увеличение объектива 90, окуляра х5. Предметное стекло с фиксированными на нем гранулами устанавливали на столике микроскопа и находили их в поле зрения объектива. Выбранный зонд (0,5) фотометрической насадки совмещали с фотометрируемым участком гранулы и при максимально закрытой диафрагме снимали цифровые значения флюоресценции гранул на вольтметре. Высчитывали среднее значение свечения 6 гранул, а также среднее значение флюоресценции фона. Разница свечения гранул и фона выражается в относительных единицах флюоресценции (мв) и характеризует интенсивность свечения препарата. Положительной считали интенсивность флюоресценции гранул, достоверно отличающуюся от интенсивности свечения контрольных параметров. При отсутствии фотометрической насадки интенсивность свечения можно измерять классическим методом по 4-балльной системе.

П р и м е р 4. Определение чувствительности препарата.

Для доказательства чувствительности препарата ставили реакцию иммунофлюоресценции с использованием 40 сывороток больных ревматизмом. Традиционным методом (на срезах сердца белой крысы) АКА выявлены у 28 человек, в то время как на иммобилизированном антигенном препарате АКА выявлены в 100% случаев, причем титр АКА на срезах в основном колебался от 1:5-1:40, в 7% случаев от 1: 80-1:320, в то время как на иммобилизированном гранулированном антигенном материале в 95% случаев титр составлял 1:40-1:320, а в 5% 1:640. Чувствительность повышается за счет увеличения концентрации антигена в иммобилизированном препарате (повышение концентрации антигена в 4 раза, увеличение чувствительности в 8 раз).

П р и м е р 5. Определение специфичности препарата.

Специфичность препарата определяли следующим образом:

После обработки сывороткой больного иммобилизированный гранулированный антигенный препарат обрабатывали иммунной флюоресцентной нормальной сывороткой, специфического свечения не отмечалось. После обработки препарата сывороткой донора с последующей обработкой сывороткой против иммуноглобулинов человека специфического свечения не отмечалось.

Иммобилизированный гранулированный антигенный материал обрабатывали сывороткой больного (заведомо положительной), а затем соответствующей кроличьей сывороткой против иммуноглобулинов человека, сывороткой не окрашенной ФИТЦ, после промывания препарата снова обрабатывали гомологичной, но уже флюоресцирующей антисывороткой, отмечали слабое специфическое свечение.

Нами введен дополнительный контрольный тест: заведомо положительную сыворотку адсорбировали антигеном сердца крысы, затем работу данной сыворотки проверяли на гранулах и срезах, специфического свечения нет.