способ разделения альбуминов сыворотки крови

Формула изобретения

СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ АЛЬБУМИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ, включающий нанесение образца на колонку с гелем, хроматографию и элюцию белковых фракций, отличающийся тем, что используют гель, обладающий гидрофобной сорбцией Е₀ от 0,9 - 1,1.

Описание изобретения к патенту

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской биохимии, и может быть использовано для разделения альбуминов при диагностике патологий, связанных с наличием в крови больных людей модифицированных альбуминов при оценке состава коммерческих препаратов альбумина, а также для изучения природы сорбированных на альбумине лигандов.

Известен способ разделения мономерной и агрегированной форм альбумина из сыворотки крови человека на ТSK-HW-55-геле, основанный на различии в молекулярных m массах этих белков. Однако свойства геля TSK-HW-55 таковы, что он разделяет белки только по их молекулярным массам и не позволяет разделить альбумины по их гидрофобности, что необходимо для оценки нагруженности альбумина, отражающей тяжесть патологии.

Техническим результатом изобретения является разработка способа разделения альбуминов по степени их гидрофобности. Технический результат достигается тем, что в способе разделения альбуминов путем гель-проникающей хроматографии (ГПХ), согласно изобретению разделение осуществляют на геле, обладающем гидрофобной сорбцией с-Е_о от 09 до 1,1. Е_о эффективная свободная энергия взаимодействия с сорбентом стандартного гидрофобного радикала, в качестве которого принята метиленовая группа СН₂.

Сывороточный альбумин основной белок плазмы крови, выполняющий многочисленные функции. Альбумин может осуществлять транспорт жирных кислот (Ж.К. ), билирубина, углеводов, холестерина, липидов, триптофана, пептидных гормонов, лекарственных препаратов, регулировать содержание свободного кальция. Вклад альбумина в величину осмолярности плазмы крови составляет 75-80% определяя собой величину онкотического давления. Связывание с альбумином сыворотки крови человека (ЧСА) многих веществ приводит к увеличению растворимости в плазме гидрофобных лигандов (например, Ж.К.), а также к снижению токсичности некоторых метаболитов (билирубин). Способность альбуминов к модификации и связыванию лигандов позволила Фостеру сформулировать представление о микрогетерогенности препаратов альбумина. Взаимодействие с различными соединениями сопровождается конформационными перестройками белковой молекулы, что регистрируется по изменению физико-химических свойств ЧСА. В ряде работ приводятся данные о существовании модифицированных форм альбумина в крови людей при различных патологиях, причем у больных хроническим гломерулонефритом (ХГН) обнаружен параллелизм нарастания минорных (модифицированных) форм ЧСА и длительности заболевания. Возможность использования модифицированных форм альбумина для выработки дифференциально-диагностических критериев и прогноза течения заболевания приводит к необходимости количественной оценки доли модифицированных форм ЧСА, в связи с чем появилась задача разделения разных форм альбумина.

Предлагается, что для разделения смеси альбуминов необходимо использовать гель, реагирующий на различную степень гидрофобности молекул ЧСА, обладающий гидрофобной сорбцией. Степень гидрофобных взаимодействий увеличивается в интервале нарастания параметра гидрофобности сорбента Е_о от 0,9 до 1,1 и выше. Гель TSK-HW-55 практически не проявляет гидрофобного взаимодействия с альбумином (Е_о 0,6-0,7), ГПХ на TSK-HW-55-геле при данных условиях элюции имеет вид чистого фракционирования по молекулярным массам. При использовании геля, обладающего гидрофобной сорбцией с -Е_о более 1,1, белки настолько прочно связываются с матрицей, что для их элюции необходимо использовать специальные приемы, что вызывает изменение вторичной структуры белка. В данном изобретении использованы матрицы, обладающие гидрофобной сорбцией с параметром Е_о от 0,9 до 1,1. Таким образом, сочетание эффекта ситования (фракционирования по молекулярным массам) и эффекта гидрофобных взаимодействий на данных гелях дает хорошее разрешение, что позволяет выделить различные по свойствам, нагруженные разными лигандами альбумины.

Способ может быть осуществлен следующим образом. Из сыворотки крови человека осаждают глобулины методом высаливания при 33% насыщения сульфата аммония в условиях при постоянном перемешивании в течение двух часов при комнатной температуре. Суспензию центрифугируют при 700 g в течение 10 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость наносят на колонку фирмы "Фармация" длиной 70 см, диаметром 1,6 см, заполненную гидрофобным гелем с Е_о 0,9-1,1. Объем наносимой пробы 2,6 мл, концентрация белка 35-45 мг/мл. Элюцию проводят 0,01 М фосфатным буфером рН 6,8 с 0,15 М хлоридом натрия. Скорость элюции 0,22 мл/мин. Регистрацию оптической плотности проводят на Увикорде S-2 фирмы "Фармация". Пробы объемом в 1 мл собирают в пробирки и далее используют для флуоресцетного анализа и иммунопреципитации (иммунохимический метод) с применением поликлональных антител к альбумину производства Behring Institut (Германия). Концентрацию белка в пробах определяют по методу. Bradforda (Bradford M.M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding.// Anal. Biochem. 1976.-V.72-p. 248-254). В качестве критерия, позволяющего судить о негомогенности или гомогенности препарата белка в каждом пике профиля элюции используют регистрацию величины спектрального параметра А (А J₃₂₀/J₃₆₅, где J₃₂₀ и J₃₆₅ интенсивности в спектрах флуоресценции при длинах волн 320 и 365 нм, соответственно). В тех случаях, когда на протяжении всего пика не обнаруживается постоянство параметра А, нельзя делать вывод о гомогенности белка в этом пике. В качестве контрольного препарата используют раствор альбумина фирмы "Reanal" в 33% насыщения сульфата аммония.

На фиг. 1-3 представлены профили элюции альбуминов сыворотки крови больного (б) и здорового донора (а) и изменение параметра А. Разделение альбуминов проводили на гелях, обладающих гидрофобной сорбцией Е_о 0,9-1,1.

П р и м е р 1. На фиг. 1 представлены профили элюции и изменение параметра А альбуминов сыворотки крови здорового донора (а) и больного (диагноз: гломерулонефрит с минимальными изменениями) (б), полученные после разделения на геле с Е_о= 0,9. Объем выхода мономерной фракции для этого геля по альбумину фирмы "Reanal" составляет 68-86 мл (А_ср. 0,92); процент содержания альбумина 100% На профиле элюции альбуминов сыворотки крови донора (а) получено 2 пика, причем во втором пике в объеме 76-84 обнаружено постоянство параметра А (А_ср. 1.09) и 77% альбумина, что дает возможность говорить о наличии в этом пике гомогенного белка. По объему выхода и коэффициенту распределения сделан вывод о том, что этим гомогенным белком является мономер альбумина. На профиле элюции альбуминов сыворотки крови больного (б) получено также 2 пика, однако незначительные изменения параметра А зарегистрированы лишь во втором пике в объекте 77-86 мл, доля альбумина составляет 75% Следовательно, фракционирование на этом сорбенте не позволяет получить достаточно обогащенную фракцию мономерного альбумина.

П р и м е р 2. На фиг. 2 представлены профили элюции и изменение параметра А альбуминов сыворотки крови того же здорового донора (а) и того же больного (б), что и в первом примере, полученные после разделения на геле с Е_о 1,1. Объем выхода мономерной фракции для этого геля по альбумину "Reanal" составляет 74-94 мл (А_ср.0,94). Содержание альбумина 100% На профиле элюции альбуминов сыворотки крови донора (а) получено 3 пика; постоянство параметра А обнаружено на всем протяжении 2-го пика, вплоть до середины 3-го пика (объем 77-88 мл, А _ср. 1,12). Во втором пике иммунохимическим методом зарегистрировано 90% альбумина. Следовательно, мономерная фракция альбумина донора выходит на этом геле в объеме 77-88 мл. Профиль элюции альбуминов сыворотки крови больного дает также 3 пика; постоянство параметра А обнаружено на протяжении 2-го пика (А_ср. 1,08) и на другом уровне в 3-м пике (А_ср. 1,15), что дает возможность предположить наличие в каждом из этих пиков гомогенного белка; однако по проценту содержания альбумина, обнаруженному во 2-м пике (90%), можно делать вывод о том, что фракция мономерного альбумина на этом геле выходит в объеме 86-92 мл (2-й пик). Следовательно, гель с Е_о 1,1, обладая как эффектом ситования, так и эффектом гидрофобной сорбции, дает возможность разделять альбумины как по их молекулярным массам, так и по степени гидрофобности.

П р и м е р 3. На фиг. 3 представлены профили элюции и изменение параметра А альбуминов сыворотки крови того же здорового донора (а) и того же больного (б), что и в первом примере, полученные после разделения на ТSK-Hw-55-геле. Объем выхода мономерной фракции для этого геля по альбумину "Reanal" составляет 72-86 мл (А_ср.0,91). Содержание альбумина 100% На профиле элюции альбуминов сыворотки крови донора получен 1 пик, на протяжении которого зарегистрировано изменение параметра А, но доля альбумина довольно высока: 74% Профиль элюции альбуминов сыворотки крови больного демонстрирует 2 пика, причем доля альбумина во 2-м пике составляет 76% параметр А изменяется на протяжении обоих пиков. Следовательно, на ТSK-Hw-55-геле, не обладающем эффектом гидрофобной сорбции, невозможно выделить гомогенную по параметру А фракцию альбумина как из сыворотки крови донора, так и из сыворотки крови больного.

Использование предлагаемого способа позволяет разделять альбумины по степени их гидрофобности.