Поиск патентов
ПАТЕНТНЫЙ ПОИСК В РФ

штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko, используемый для получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью

Классы МПК:C12N5/04 клетки или ткани растений
C12N9/36 действующие на бета-1,4-связи между N-ацетилмурамовой кислотой и 2-ацетиламино-2-дезокси-D-глюкозой, например лизоцим
Автор(ы):, , , , , ,
Патентообладатель(и):Биолого-почвенный институт Дальневосточного отделения РАН
Приоритеты:
подача заявки:
1993-06-25
публикация патента:

Использование: биотехнология, сельское хозяйство и медицина. Сущность изобретения: штамм ErSR получен из дикорастущего растения незабудочника сихотинского в фазе цветения. Ростовой индекс культуры 10штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 2044052 3. Штамм культивируемых клеток растений ErSR является новым источником для биотехнологического получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью. Препарат представляет собой белковую фракцию, выделенную из биомассы клеток штамма ErSR, и имеет следующие характеристики ( из расчета на 1 г сырых клеток ): концентрация белка 2,05 мг, суммарная хитиназная активность 4210 мкМ, суммарная хитозаназная активность 585 мкМ, удельная хитиназная активность 2050 мкМ/мг, удельная хитозаназная активность 285 мк/мг. 3 табл.

Рисунки к патенту РФ 2044052

Рисунок 1, Рисунок 2

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в сельском хозяйстве и медицине. Штамм культивируемых клеток растений Eritrichium incanum (Turcz. ) A.DC. ssp. sichotense (M.Pop.) Starchenko (ErSR) является новым доступным источником ферментов углеводного обмена хитиназы и хитозаназы, которые расщепляют штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 2044052 -1,4-гликозидные связи в широко распространенных в природе биополимерах хитине и хитозане. В результате реакций расщепления хитина и хитозана образуются полисахариды низкой молекулярной массы, смесь олигосахаридов, аминосахаров. Хитиназа и хитозаназа распространены в растениях и необходимы для борьбы с фитопатогенами, грибными и вирусными инфекциями с насекомыми [1] В свою очередь продукты, получаемые из хитина и хитозана с помощью ферментативной деградации, сами являются ингибиторами фитопатогенов, увеличивают устойчивость растений к грибковым заболеваниям, проявляют элиситорную активность, обладают противоопухолевой и иммуностимулирующей активностью.

До недавнего времени хитиназы и хитозаназы выделяли из микроорганизмов и только в последние годы в качестве источников этих ферментов были использованы клеточные культуры риса [2] Данные по использованию незабудочника сихотинского, как источника получения хитиназы и хитозаназы в литературе отсутствуют.

Поиск доступных источников хитиназ и хитозаназ имеет научный и практический интерес, так как позволит получать не только высокоактивные ферментные препараты, но и с их помощью модифицированные производные хитина и хитозана, широко используемые в сельском хозяйстве и медицине природные биологически активные вещества.

Целью изобретения является получение активно растущего штамма клеток незабудочника сихотинского Eritrichium sichotense (M.Pop.) Starchenko, являющегося продуцентом хитиназы и хитозаназы.

Штамм Eritrichium sichotense (ErSR) получен и находится на депонировании во Всероссийской коллекции клеточных культур, а именно в специализированной коллекции клеток высших растений Института физиологии растений им. К.А.Тимирязева Российской Академии Наук под коллекционным номером 50.

Описание и сходного материала. Исходным материалом для получения штамма ErSR было дикорастущее растение незабудочника сихотинского в фазе цветения, найденное в Приморском крае, Партизанском районе на южном склоне известнякового хребта Чандалаз (Лазовый) в мае 1990 года. Эксплантом служили кусочки поперечного среза корней размером 3-4 мм.

Культуральные свойства. Растущая каллусная культура представляет собой мягкую ткань рыхлой консистенции светло-серого цвета без запаха. Ростовой индекс 10штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 20440523 для каллусов начальной массой 200 мг. Живых клеток 91-95% в середине стадии экспоненциального роста, содержание сухого вещества 2,7% Штамм ErSR выращивают при температуре 25 штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 2044052 1оС, относительной влажности воздуха 60 штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 2044052 10% в темноте на питательной среде следующего состава, мг/л воды: NH4NO3 1300-1950 KNO3 1500-2300 KH2PO4 150-190 CaCl2 x 6H2O 600-730 MgSO4 x 7H2O 350-390 H3BO3 4,2-8,0 MnSO4 x 4H2O 15,6-26,7 CuSO4 x 5H2O 0,02-0,03 CoCl2 x 2H2O 0,02-0,03 ZnSO4 x 7H2O 6,0-10,3 Na2MoO4 x 2H2O 0,2-0,3 KI 0,52-0,90 FeSO4 x 7H2O 25,0-30,6 Na2EDTA x 2H2O 33,6-41,0 Мезо-инозит 80-120 Никотиновая кислота 0,4-0,6 Пиридоксина гидрохлорид 0,4-0,6 Тиамин хлорид 0,15-0,25 Глицин 1-3 6-Бензиламинопурин 0,25-0,75 штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 2044052 -нафтилуксусная кислота (АНУ) 1-3 Казеина гидролизат 40-60 Сахароза 25000-35000 Агар 5800-6200 Вода До 1 л

рН среды 5,2-5,6 до автоклавирования.

Ткань культивируется в пробирках емкостью 50 мл, содержащих 15 мл питательной среды или в колбах Эрленмейера емкостью 100 мл 30 мл питательной среды. Продолжительность цикла выращивания 28 сут. Номер пассажа 34.

Цитологические и кариологические характеристики штамма ErSR.

Ткань представляет собой гетерогенную популяцию, состоящую из двух групп клеток. Первая группа клетки меристематического типа овальной или удлиненной формы, имеющие средние размеры 50 х 64 мкм, содержание которых в популяции 36-91% Вторая группа клетки паренхимного типа тоже овальной или удлиненной формы, но более крупные, средние размеры 94-145 мкм, содержание их в популяции 9-64%

Максимум митотической активности наблюдается на 24 и 30 сут культивирования, митотический индекс 10,4 и 10,6% соответственно.

Распределение клеток по числу хромосом штамма ErSR дано в табл.1

Способность к морфогенезу отсутствует.

Характеристика хитиназной и хитозаназной активности препарата, полученного из биомассы штамма ErSR незубудочника сихотинского.

После окончания цикла культивирования (28 сут) сырую биомассу клеток собирают, белки экстрагируют 0,03 М трис-HCl буфером рН 7,0 и концентрируют сульфатом аммония. Полученная белковая фракция представляет собой препарат, обладающий хитиназной и хитозаназной активностью. Ферментативную активность препаратов из биомассы штамма ErSR определяют по методу Нельсона, используя в качестве субстратов 1%-ную суспензию коллоидного хитина и 5%-ный раствор хитозана. Препарат, полученный из штамма ErSR, имеет следующие характеристики из расчета на 1 г сырых клеток биомассы: концентрация белка 2,05 мг

суммарная хитиназная активность 4210 мкМ

суммарная хитозаназная активность 585 мкМ

удельная хитиназная активность 2050 мкМ/мг

удельная хитозаназная активность 285 мкМ/мг

В табл. 2 приведены характеристики препаратов, полученных из биомассы клеток в процессе долговременного культивирования штамма.

Использование штамма иллюстрируется следующим примером.

В пробирки емкостью 50 мл наливают по 15 мл питательной среды следующего состава, мг/л воды: NH4NO3 1650 KNO3 1900 KH2PO4 170 CaCl2 x 6H2O 665 MgSO4 x 7H2O 370 H3BO3 6,2 MnSO4 x 4H2O 22,3 CuSO4 x 5H2O 0,025 CoCl2 x 2H2O 0,025

ZnSO4 x 7H2O 8,6 Na2MoO4 x 2H2O 0,25 KI 0,83 FeSO4 x 7H2O 27,8 Na2EDTA x 2H2O 37,3 Мезо-инозит 100 Никотиновая кислота 0,5 Пиридоксина гидрохлорид 0,5 Тиамин хлорид 0,2 Глицин 2,0 6-Бензиламинопурин 0,5 штамм культивируемых клеток растений eritrichium incanum   (turcz.) a.dc.ssp. sichotense (m.pop.) starchenko,   используемый для получения препарата, обладающего   хитиназной и хитозаназной активностью, патент № 2044052-нафтилуксусная кислота (АНУ) 2,0 Казеина гидролизат 50 Сахароза 30000 Агар 6000

рН среды 5,5 до автоклавирования

Пробирки со средой стерилизуют при 117оС в течение 20 мин, а затем в асептических условиях в каждую пробирку помещают по 200 мг клеточной биомассы штамма ErSR. Культивирование проводят в темноте при 24оС и относительной влажности воздуха 60% в течение 28 сут. Затем биомассу снимают с поверхности питательной среды, взвешивают. В каждой пробирке накапливается по 2,5-3,0 г сырой биомассы. Сырую биомассу собирают с поверхности питательной среды, экстрагируют 0,03 М трис-HCl буфером рН 7,0, содержащим 0,9% NaCl, гомогенизируют и выдерживают при 4оС в течение 12 ч. Супернатант сливают, а осадок экстрагируют дважды. Из объединенного супернатанта выделяют белковую фракцию путем высаливания сульфатом аммония (60% насыщение). Сформированный осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин при 4оС. Осадок растворяют в небольшом объеме 0,03 М трис-HCl буфера рН 7,0 и диализуют против буфера до удаления сульфата аммония.

Белковая фракция представляет собой препарат, обладающий хитиназной и хитозаназной активностью.

Оценка хитиназной и хитозаназной активности препарата.

Для определения хитаназной активности белкового препарата в пробу добавляют 2 мл буфера рН 5,0, 50 мкл 1%-ной суспензии хитина и 0,1-0,2 мл белковой фракции. Реакционную смесь инкубируют в течение 12 ч при 37оС. Нерастворившийся хитин отделяют центрифугированием. Хитиназную активность определяют по количеству образовавшихся при ферментолизе восстанавливающих сахаров по методу Нельсона. За единицу активности хитиназы принимают такое количество фермента, которое освобождает при ферментолизе 1 мкМ восстанавливающих углеводных групп. За эквивалент в случае хитиназы принимают N-ацетилглюкозамин.

Для определения хитозаназной активности белкового препарата в пробу добавляют 2 мл трис-HCl буфера рН 7,0, 50 мкл 5%-ного раствора хитозана и 0,1-0,2 мл белковой фракции. Реакционную смесь инкубируют также, как и в случае определения хитиназной активности, в течение 12 ч при 37оС. За эквивалент в этом случае принимают глюкозамин. Количество белка определяют спектрофотометрическим методом. Одна оптическая единица принимается равной 1 мг белка. Удельная активность фермента определяется как количество единиц активности в 1 мг белка.

Хитиназная и хитозаназная активность препарата, полученного из штамма ErSR.

Ферментативная активность всех препаратов определена из расчета на 1 г сырых клеток биомассы штамма ErSR (табл.3).

Из данных табл.3 максимальная удельная активность хитиназы приходится на 28 сут, а хитозаназы на 14 сут культивирования.

Таким образом, штамм ErSR культивируемых клеток растений Eritrichium sichotense является высокопродуктивным и возобновимым источником для биотехнологического получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью.

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Штамм культивируемых клеток растений Eritrichium incanum (Turcz) A.DC. ssp. sichotense (M. Pop.) Starchenko ErSR ВККК (ВР) N 50, используемый для получения препарата, обладающего хитиназной и хитозаназной активностью.

Патентный поиск по классам МПК-8:

Класс C12N5/04 клетки или ткани растений

Патенты РФ в классе C12N5/04:
способ получения клеточной суспензионной культуры трансгенного табака nicotiana tabacum l., содержащего ген uida -  патент 2519652 (20.06.2014)
питательная среда для размножения яблони и груши in vitro -  патент 2486237 (27.06.2013)
растительная клеточная линия, полученная из камбия травянистого растения с запасающим корнем, и способ ее выделения -  патент 2467067 (20.11.2012)
способ конструирования массы миокардиальных клеток и применение массы миокардиальных клеток -  патент 2467066 (20.11.2012)
растительная стволовая клеточная линия, полученная из покоящегося центра, и способ ее выделения -  патент 2458122 (10.08.2012)
способ культивирования каллусной ткани centaurea scabiosa l -  патент 2458121 (10.08.2012)
способ микроклонального размножения лиственницы сибирской в культуре in vitro через соматический эмбриогенез на среде аи для плантационного лесовыращивания -  патент 2456344 (20.07.2012)
штамм культивируемых клеток растения стефания гладкая ифр sg 26127 (stephania glabra (roxb.) miers) в условиях in vitro - продуцент стефарина -  патент 2453598 (20.06.2012)
питательная среда для микроразмножения лимонника китайского (schisandra chinensis (turcz.) baill.) в условиях in vitro -  патент 2440414 (20.01.2012)
способ получения каллусной ткани лотоса орехоносного -  патент 2429290 (20.09.2011)

Класс C12N9/36 действующие на бета-1,4-связи между N-ацетилмурамовой кислотой и 2-ацетиламино-2-дезокси-D-глюкозой, например лизоцим


Наверх